距瓣豆对盐胁迫的生理响应及综合评价

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质 创制重点实验室， 海南 儋州 571737)

距瓣豆(Centrosemapubescens) 又称蝴蝶豆或毛蝶豆，属蝶形花科，是一种适用于热带地区产量高、抗逆性强、适口性好的优良热带豆科牧草[1]，常被作为绿肥广泛用于橡胶园、果园等。据报道，在云南，距瓣豆作为绿肥在开割胶园中，有机碳含量增多[2]，酸性磷酸酶活性增强[3]，促进土壤中磷的循环[4]，说明距瓣豆覆盖胶园后适应性强，开发价值高[5-6]，对土壤肥力有一定的提升和维持作用[7]。在甘蔗园中套种距瓣豆,不仅可以改善饲草的营养价值，而且可以提高单位面积的饲草产量和质量[8]。

表1 20份距瓣豆种质明细

材料编号品系名采集地经度纬度海拔1CIAT25118CIAT引入2CIAT5627CIAT引入3050321040海南五指山10930.9601847.948363.004CIAT873CIAT引入5050320026海南保亭什岭镇10951.1741839.23372.606020401049海南万宁长丰11012.00022601.03518.507CIAT5631CIAT引入8071103014海南儋州10930.0641930.934119.609020301004海南三亚10944.0791926.93012.2010060219004海南昌江10901.0191915.56851.7011050321038海南保亭10938.1951827.214111.2012050320020海南陵水11000.1811834.12635.0013050320027海南保亭10951.1741839.23372.6014060219003海南昌江10901.0191917.98451.7015CIAT5189CIAT引入16050320021海南陵水提蒙11000.1811834.12635.0017050321057海南白沙10929.7281909.102190.1018071029001海南乐东10912.7501842.256204.8019050319008海南昌江大坡10901.6401917.984112.8020南02139南繁基地引入

注：CIAT为哥伦比亚国际热带农业中心。

我国盐渍化土地面积随着环境恶化及不合理开发，已超过可耕地总面积的25%，并还在增加[9]。因此，如何改良和开发利用盐渍化土地，已经成为当前必须解决的大事[10-11]。研究表明，利用植物改良盐碱化土地是最经济、最有效的措施之一[12-14]。

目前，对于蝴蝶豆的研究集中在施肥[15-18]、产量[19-20]、耐荫性[21]、抗旱性[22]及发芽方法[23]等方面，耐盐性方面的研究还未见报道，而蝴蝶豆作为重要的热带亚热带豆科牧草，研究其耐盐性的生理变化，弄清其耐盐机理，对选育优良的品种和提高牧草的产量具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

距瓣豆种质材料共20份(见表1)，由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草中心提供。

1.2 试验设计

试验于2014年7月在中国热带农业科学院品种资源作物研究所牧草中心温室大棚中进行，室内平均最高温度(31.8±3)℃，平均最低温度(21.0±3)℃，平均相对湿度(60±5)%，采用苗期盐境胁迫法。为了确定距瓣豆品系苗期耐盐性筛选的适宜盐浓度，用CIAT 25118、050321040、020401049、060219004、071029001等5份种质为材料，分别采用4、6、8、10、12、14 g·L-1盐浓度进行预试验。通过叶绿素及植株生长情况，发现植株在10 g·L-1盐浓度胁迫下，品系间各生长指标差异显著，因而将10 g·L-1盐浓度定为距瓣豆属种质苗期耐盐性鉴定的适宜盐浓度，以蒸馏水为对照，3次重复。在花盆中(内口径21 cm，高25 cm，每盆装入5.5 kg表土)育苗，保证每盆4～5株长势一致的苗，2个月后待苗生长至30 cm时，按10 g·L-1NaCl进行盐胁迫处理，每处理3次重复，处理第15天分别测定叶绿素(SPAD)、质膜透性(relative electrical conductivity rate，REC)、游离脯氨酸含量(free praline contents，Pro)、丙二醛含量(malondialdehyde，MDA)、叶片相对含水量(relative water content，RWC)。

1.3 指标测定

测定指标均参照《植物生理学实验指导》[24]，叶绿素含量(Chl)用叶绿素仪对距瓣豆由上至下第5片叶子进行直接测定；质膜透性的测定采用电导仪法；游离脯氨酸(Pro)含量的测定采用酸性茚三酮法；丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸法。

1.4 距瓣豆种质材料苗期耐盐性综合评价

1) 为了减小试验材料间本身的差异，使用各指标的相对值来表示，耐盐性常用耐盐指数(salt tolerance trait index，STTI)表示。

表2 不同处理时间和不同浓度下的叶绿素相对值的变化 单位：%

材料编号 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT25118135.11a127.59ab134.91a142.96a85.65—CIAT5627126.16ab144.41a130.58ab120.15ab104.93—05032104092.70abc88.95ab100.14abc90.13ab90.23—CIAT87383.04bc97.14ab81.2bc74.39b——05032002689.28abc101.10ab84.96abc89.34ab81.86—02040104992.67abc84.91b92.77abc91.55ab74.30—CIAT563188.02abc88.21b83.43abc73.80b76.68—07110301491.22abc97.63ab90.40abc79.89b79.30—02030100475.85c73.67b75.88c73.73b68.25—060219004102.03abc100.41ab98.72abc103.18ab93.88—05032103893.38abc90.78ab78.67bc73.77b78.28—05032002099.73abc102.51ab84.56abc83.95ab72.59—050320027117.92abc112.04ab107.65abc122.12ab126.08—060219003116.17abc106.26ab106.31abc74.25b82.55—CIaT5189118.81abc107.58ab106.06abc104.71ab99.70—050320021118.33abc104.22ab91.26abc87.14ab103.71—050321057109.79abc103.14ab96.82abc———07102900197.59abc95.07ab93.91abc79.14b68.27—050319008108.42abc102.42ab84.72abc93.84ab80.58—南0213999.87abc94.19ab85.42abc81.75b93.47—平均值102.80101.1195.4291.5786.68—标准误15.5015.1015.7519.3214.93—显著性****ns—

注：表中小写字母表示(p<0.05)差异显著，ns表示差异不显著。下同。

STTI=(处理指标值/对照指标值)×100%。

2) 隶属函数分析距瓣豆种质参试材料利用下列隶属函数公式(1)、(2)求得：

i=4,8,12，j=1,2,,n

(1)

i=4.8,12，j=1,2,,n

(2)

判断各项指标是正相关还是负相关，如果是正相关则用公式(1)计算，如果是负相关则用公式(2)计算。

式中，i表示浓度为i的第j个综合指标值；Xi(min)表示浓度i综合指标当中的最小值；Xi(max)表示浓度i综合指标当中的最大值。

3) 聚类分析用SAS 9.1软件进行方差分析，利用Excel软件进行隶属函数计算,以及用SPSS 18.0进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫对距瓣豆生理指标的影响

2.1.1盐胁迫对距瓣豆叶绿素含量的影响

由表2可以看出，距瓣豆的叶绿素含量随着浓度的增大呈下降趋势，但也会因为试验环境严谨性不高而有波动。在盐胁迫第8天时，不同浓度盐处理的距瓣豆属种质间的叶绿素相对值差异显著，其中盐浓度为4 g·L-1，有9份距瓣豆种质的相对叶绿素值大于100%，CIAT 25118的叶绿素值最高，达135.11%，显著高于CIAT 873、020301004距瓣豆；盐浓度8 g·L-1，有11份距瓣豆种质的叶绿素值高于对照，CIAT 5627的叶绿素值最高，达144.41%，显著高于020401049、CIAT 5631、020301004距瓣豆；盐浓度12 g·L-1时，有6份距瓣豆种质的叶绿素值高于对照，CIAT 25118的叶绿素值最高，达134.91%，显著高于CIAT 873、020301004、050321038距瓣豆。

当盐胁迫至15 d时，盐浓度为4 g·L-1时，050321057距瓣豆死亡，5份距瓣豆种质的相对叶绿素值大于100%；盐浓度为8 g·L-1时，CIAT 873、050321057距瓣豆死亡，3份距瓣豆种质的相对叶绿素值大于100%；盐浓度为12 g·L-1时，20份距瓣豆全部死亡。

2.1.2盐胁迫对距瓣豆质膜透性的影响

由表3可知，在盐胁迫处理第8天时，当盐浓度4 g·L-1时，20份距瓣豆种质间的相对质膜透性差异不显著，有8份距瓣豆的相对质膜透性值大于100%，其中CIAT 873距瓣豆的相对质膜透性值最大，达115.85%；当盐浓度8 g·L-1时，20份距瓣豆种质间的相对质膜透性差异达极显著，其中60219003距瓣豆的相对质膜透性值最大(134.23%)，极显著高于050321038、050320027、CIAT 5189、050320021、071029001距瓣豆；当盐浓度达到12 g·L-1时，相对质膜透性差异不显著，有10份距瓣豆种质的相对质膜透性大于100%，其中60219003距瓣豆的相对质膜透性值最大(140.61%)。

表3 不同处理时间和不同浓度下的质膜透性相对值的变化

材料编号 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT25118111.2497.40ab107.64112.81ab124.36—CIaT5627102.9487.83ab98.1468.40b91.28—050321040109.2898.45ab107.38102.85ab140.43—CIaT873115.85112.60ab111.61120.60ab——050320026103.92106.06ab99.9687.71ab108.06—02040104996.96101.15ab119.1790.35ab138.37—CIaT5631111.98111.75ab126.85127.54ab145.18—07110301495.81115.41ab124.7884.20ab117.18—02030100490.7296.59ab85.7087.41ab120.09—06021900494.7285.54ab90.6978.79ab97.68—05032103894.8077.39b99.8388.84ab111.97—05032002088.0798.06ab76.7578.50ab98.59—05032002777.6777.09b104.4765.49b91.05—060219003106.47134.23a140.61139.15a91.34—CIaT518987.3081.64b96.4975.24ab115.44—05032002191.5280.81b80.9378.31ab99.99—05032105799.4696.40ab96.98———07102900184.4377.05b97.8786.58ab122.15—05031900899.2891.18ab116.10103.82ab113.96—南02139105.9996.20ab128.4793.07ab118.94—平均值98.4296.14105.5293.14113.67—标准误10.1214.8716.7120.0016.81—显著性ns*ns*ns—

在处理第15天时，20份距瓣豆种质材料的相对质膜透性随着盐浓度的升高而升高。其中盐浓度为4 g·L-1时，相对质膜透性值最大的是060219003(139.15%)，盐浓度为8 g·L-1时，相对质膜透性值最大的是CIAT 5631(145.18%)，当盐浓度达12 g·L-1时，20份距瓣豆种质均无存活。

2.1.3盐胁迫对距瓣豆脯氨酸含量的影响

由表4可看出，不同盐胁迫处理时间及浓度对距瓣豆种质间的相对脯氨酸含量差异均不显著。盐胁迫处理第8天时，从相对游离脯氨酸含量的平均值看，盐浓度为4 g·L-1与8 g·L-1时差异很小，二者仅相差0.37%。当盐浓度达到12 g·L-1时，相对游离脯氨酸含量急剧上升，较浓度为4 g·L-1时增长16.84%，较浓度为8 g·L-1时增长17.48%。

盐胁迫处理第15天时，盐浓度为4 g·L-1时的相对游离脯氨酸平均值与8 g·L-1时差异很小，二者仅相差0.49%；当盐浓度为12 g·L-1时，20份距瓣豆种质均死亡。

2.1.4盐胁迫对距瓣豆丙二醛含量的影响

由表5可知，不同盐胁迫处理时间及浓度对距瓣豆种质间的相对丙二醛含量差异均达极显著。胁迫处理第8天，盐浓度为4 g·L-1时，20301004距瓣豆的相对丙二醛含量极显著高于071103014距瓣豆，差异达8.77倍；盐浓度为8 g·L-1时，南02139距瓣豆的相对丙二醛含量最大，达336.70%，极显著高于除050320027、060219003距瓣豆外的剩余17份距瓣豆种质；盐浓度为12 g·L-1时，南02139距瓣豆的相对丙二醛含量最大，达441.70%，极显著高于除050321040、050320027距瓣豆外的剩余17份距瓣豆种质。

胁迫处理到第15天，盐浓度为4 g·L-1时，南02139距瓣豆的相对丙二醛含量极显著高于剩余的19份距瓣豆，达125.18%；盐浓度为8 g·L-1时，050320027距瓣豆的相对丙二醛含量最大，达217.60%，极显著高于除050321040、050321038、南02139距瓣豆的剩余16份距瓣豆种质，盐浓度为12 g·L-1时，苗已处理致死。

表4 不同处理时间和不同浓度下的游离脯氨酸含量相对值的变化 单位：%

材料编号 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT2511868.9867.2569.0668.7867.68—CIAT562768.9366.7171.2967.9467.84—05032104069.5667.9393.9978.1479.07—CIAT87368.2667.0075.2178.09——05032002667.8367.3673.2367.7568.55—02040104967.2468.5181.0573.1171.24—CIAT563168.6365.4671.4266.1265.75—07110301466.9067.04122.3566.9366.61—02030100468.0067.2577.1374.9061.03—06021900467.7467.2766.8267.5968.29—05032103867.2168.7868.4268.7975.22—05032002067.1367.1168.0670.8570.29—05032002768.4666.7571.0367.9854.39—06021900367.4770.6184.5456.2282.33—CIAT518966.0165.3972.9666.7077.97—05032002166.9167.7076.6567.3879.12—05032105768.4168.1590.11———07102900167.5766.9777.3971.9451.41—05031900867.7967.72103.9773.5685.05—南0213967.4968.2370.2868.4371.42—平均值67.8367.4679.2569.6970.18—标准误3.216.859.162.987.75—显著性nsnsnsnsns—

表5 不同处理时间和不同浓度下的丙二醛含量相对值的变化

材料编号 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT25118104.20ab63.90b152.60b140.83b126.70b—CIaT562792.80ab100.80b76.40b91.64b135.60b—050321040157.60ab83.80b316.50ab137.23b184.38ab—CIaT87388.10ab80.70b158.10b94.06b——05032002693.00ab89.20b100.70b55.77b86.90b—020401049117.30ab80.90b116.80b87.79b74.60b—CIaT563195.90ab95.60b151.40b65.71b91.20b—07110301461.50b55.20b83.00b35.84b50.10c—020301004539.40a73.30b93.30b32.77b73.60b—060219004114.70ab109.60b225.40b93.38b97.60b—050321038118.80ab25.60b159.90b110.02b167.40ab—05032002089.90ab55.70b85.10b42.75b87.70b—050320027233.80ab227.50ab309.00ab118.91b217.60a—06021900384.40ab278.40ab112.40b89.32b146.40b—CIaT5189104.80ab79.80b139.80b74.42b75.30b—05032002178.80ab41.60b125.30b80.32b128.30b—050321057108.00ab76.20b191.70b-——071029001133.90ab99.20b148.00b55.31b94.71b—050319008117.50ab44.40b106.10b63.01b108.47b—南02139172.40ab336.70a441.70a125.18a204.60ab—平均值135.34104.91164.6683.91119.51—标准误20.8910.5631.4514.659.97—显著性*****—

表6 各指标在浓度为8 g·L-1时的隶属函数值对比分析和综合评价

编号材料 隶属函数值 综合评价 μ1丙二醛μ2脯氨酸μ3质膜透性μ4叶绿素μ平均数排序1CIAT251180.5430.5160.3850.3010.436122CIAT56270.4900.5120.9960.6340.658230503210400.1980.1780.0880.3800.2111840503200260.7800.4900.6860.2350.548550204010490.8540.4110.1260.1050.374136CIAT56310.7550.5740.0000.1460.3691470711030141.0000.5480.5170.1910.564480203010040.8600.7140.4640.0000.5101090602190040.7160.4980.8780.4430.6343100503210380.3000.2920.6140.1730.34517110503200200.7760.4390.8610.0750.5389120503200270.0000.9111.0001.0000.7281130602190030.4250.0810.9950.2470.4371114CIAT51890.8500.2100.5490.5440.5388150503200210.5330.1760.8350.6130.5397160710290010.7341.0000.4250.0000.5406170503190080.6520.0000.5770.2130.3611518南021390.0780.4050.4850.4360.35116

图1 不同距瓣豆耐盐性聚类图

2.2 距瓣豆盐胁迫的综合评价

2.2.1隶属函数分析

在盐胁迫第15天时，对盐浓度8 g·L-1条件下测定叶绿素、质膜透性、脯氨酸、丙二醛进行隶属函数分析。除CIAT 873、050321057距瓣豆死亡外，剩下的18份距瓣豆种质的耐盐性强弱排名为：050320027>CIAT 5627>060219004>071103014>050320026>071029001>050320021>CIAT 5189>050320020>020301004>060219003>CIAT 25118>020401049>CIAT 5631>050319008>南02139>050321038>050321040。

2.2.2各材料耐盐相似性分析

将不同品种距瓣豆的隶属函数平均值进行SPSS 18.0聚类分析(平方Euclidean距离)，结果(图1)表明，聚类后分为两类：分类Ⅰ(耐盐性强)：050320020、CIAT 5189、050320021、071029001、050320026、071103014、020301004、CIAT 5627、060219004、050320027；分类Ⅱ(耐盐性弱)：CIAT 25118、060219003、050321038、南02139、020401049、CIAT 5631、050319008、050321040。

3 讨 论

植物的耐盐机理受多个基因控制，并使多个生理生化代谢过程发生改变[25-26]，从而影响植物的生长发育[27]。一般情况下，当土壤盐含量大于0.3%时，植物就会受到盐害，表现为生长缓慢，植物组织、器官生长和新陈代谢受到抑制、植株萎蔫甚至枯死[28-30]。

通过不同试验证明，在植物受逆境胁迫时，它的生理指标会出现不同程度的变化，其中叶绿素随着盐浓度处理时间增加呈下降趋势，这是由于叶绿素酶受到盐作用活性增强，促进叶绿素降解[31-33]。质膜透性随着盐浓度增加呈上升趋势[34-35]；脯氨酸随着盐浓度增加都呈现下降趋势[36-37]；丙二醛有所不同，耐盐植物的丙二醛含量波动不明显，但不耐盐品种则随着盐浓度增加而呈上升趋势[38-39]。这均与本试验中距瓣豆盐处理的结果一致。

单一指标评价植物抗逆性是片面的，目前研究多采用科学、合理的隶属函数法进行综合评价[40]。在本研究中通过采用隶属函数法对18份距瓣豆属种质耐盐性进行了综合评价，发现它们的耐盐能力强弱为：050320020>050321040>071029001>050321057>050319008>CIAT 5189>020301004>060219003>CIAT 25118>南02139>050320021>020401049>050320026>050321038>CIAT 873>CIAT 5631>CIAT 5627>060219004>050320027>071103014。

4 结 论

对20份距瓣豆种质材料在不同盐浓度下测定了叶绿素、丙二醛等生理指标，试验发现，在不同胁迫天数及不同胁迫浓度时，各品系间均存在不同程度的差异，随着盐胁迫天数的增加，叶绿素含量和质膜透性随之降低，脯氨酸和丙二醛随之增加。在盐胁迫第15天时，对20份距瓣豆材料进行隶属函数分析，耐盐能力强弱为：050320020>050321040>071029001>050321057>050319008>CIAT 5189>020301004>060219003>CIAT 25118>南02139>050320021>020401049>050320026>050321038>CIAT 873>CIAT 5631>CIAT 5627>060219004>050320027>071103014。将隶属函数分析结果进行了聚类分析，当R2=0.329，可分为两类：第Ⅰ类(耐盐型种质)：CIAT 25118、CIAT 5627、CIAT 873、050320026、020401049、CIAT 5631、071103014、020301004、060219004、050321038、050320020、050320027、CIAT 5189、050320021、南02139距瓣豆；第Ⅱ类(不耐盐种质)：050321040、060219003、050321057、071029001、050319008距瓣豆。