腺嘌呤壳聚糖纳米粒的制备及其对肿瘤细胞的影响

郁晓萌 谭旭鑫 杨可 王琪 张堃 梁恩俊 朱逸麟 于文静

（1 潍坊医学院生命科学与技术学院 山东 潍坊 261053）

（2 潍坊医学院麻醉学系 山东 潍坊 261053）

壳聚糖(Chitosan，CS)作为一种天然高分子材料，具有良好的生物活性和自然降解性，可以作为理想的抗肿瘤药物靶向制剂的载体材料。腺嘌呤(adenine，Ade)是核酸的组成成分并参与遗传物质的合成，它能促进白细胞增生，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于肿瘤化学治疗。但是腺嘌呤不溶于水，在体内代谢非常迅速，不适合口服和注射。因此在该实验中将其载进壳聚糖内，延长体内循环时间，蓄积于靶部位，提高药物治疗效果。

1.资料与方法

1.1 实验仪器与试剂

DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；Malvern Zetasizer Nano ZS 90激光粒度仪，英国Malvern公司；JEM1400透射电子显微镜，日本Jeol公司；

超声波破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；CHRIST冻干机，北京五洲东方科技发展有限公司；TU-1810紫外/可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；JHT-SSC型超净工作台，济南康宝净化设备有限责任公司；HH、CP-TW型二氧化碳恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；NIB-100型倒置显微镜，宁波永新光学股份有限公司；全自动酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；透析袋MD44（3500D），Solarbio公司，货号YA1078。

壳聚糖（粘度70mPa·S，分子量90000）；RPMI1640培养基，胎牛血清，DMSO, 均购自Solarbio公司；MTT，sigma；36%乙酸，三聚磷酸钠（TPP），1mol/L NaOH溶液，EDTA,碳酸氢钠试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 纳米粒的制备 稀释36%醋酸溶液到1%并溶解壳聚糖制备2.5mg/ml的壳聚糖醋酸溶液，用蒸馏水溶解三聚磷酸钠制备5mg/ml,6mg/ml,7mg/ml,8mg/ml的三聚磷酸钠溶液，取壳聚糖醋酸溶液20ml于单口烧瓶中，用1mol/l的NaOH溶液调节反应体系PH=5.5。25℃，500r/min磁力搅拌下缓慢（约2s每滴）分别滴加不同浓度的三聚磷酸钠溶液至刚产生乳光，继续磁力搅拌10min，得到壳聚糖空白纳米粒。

1.2.2 粒径分布及Zeta电位的测量 取适量壳聚糖空白纳米粒悬液，蒸馏水稀释10倍，超声10min，用zeta电位及粒度分析仪测定其纳米粒粒径、多分散指数（PDI）和Zeta电位的大小。

1.2.3 腺嘌呤联合壳聚糖纳米粒的制备 分别称取5mg,10mg的腺嘌呤（Ade）溶解于1ml的1,2-丙二醇溶液中，封口膜封口，超声约2h，直至溶液澄清透明。分别取5ml的TPP=5，6，7，8mg/ml的壳聚糖空白纳米粒加入上述溶液中。水浴磁力搅拌器（室温下）中搅拌过夜（或24h）。

1.2.4 粒径分布及Zeta电位的测量 方法同上1.2.2。

1.2.5 包封率和载药量的测定 透析10h以上，-80℃冻干，称取少量冻干粉，用1%的醋酸溶液溶解并稀释至10ml，然后在扫描波长处测定紫外吸光度。

包封率＝［（药物总量- 介质中未包入的药量）/药物总量］×100%。

载药量＝（微粒中含药量/微粒的总重量）×100%。

1.2.6 肿瘤细胞培养

人肝癌细胞系HepG2，细胞形态是贴壁上皮细胞，传代培养，用RPMI-1640培养液（含10%的胎牛血清），在37℃、5% CO2饱和湿度条件下常规培养。

1.2.7 MTT法检测

取处于对数生长期的HepG2细胞，以2000个/孔铺96孔板，每次3板，待过夜细胞呫壁后弃掉上清，以RPMI-1640培养基配置载药纳米粒，终浓度分别0.1ug/mL、1ug/mL、2.5ug/mL、5ug/mL、10ug/mL，每孔200uL，每组5个复孔，设调零孔和对照孔。分别于24h、48h、72h终止培养，避光添加MTT，4h后150uLDMSO溶解结晶，于540nm读取OD值。

2.结果与讨论

2.1 纳米粒的制备和形态考察

本实验采用离子凝集法制备载腺嘌呤壳聚糖纳米粒，主要以粒径及包封率为表征参数，考察制备过程中各种因素对纳米粒形成的影响。当Ade=5mg/ml、TPP=8mg/ml，反应体系PH=5.5，温度为25℃，转数500r/min时，所制得的纳米粒最优化。

2.2 空白纳米粒参数

2.2.1 zeta电位 测得平均电位为24.8。

2.2.2 粒径 平均粒径为160.7nm，PDI=0.301。

2.3 载腺嘌呤壳聚糖纳米粒参数

2.3.1 粒径 测得载药纳米粒粒径为177.6nm，PDI=0.242。结果如图1。

图1 载药纳米粒粒径图

2.3.2 zeta电位 测得载药纳米粒的电位为27.4。说明纳米粒液稳定。

2.4 包封率和载药量的测定

根据紫外/可见光光度法测定的Ade标准曲线（Y=10.474 x- 0.0082，R²=0.9996 ）得出，Ade在纳米粒中的载药量为（43.2±5.4）%；根据高效液相色谱法测定的Ade标准曲线（Y=110.38 x- 0.8672，R²=0.9999 ），得出Ade在纳米粒中的包封率为（85.7±0.58）%。

图2 Ade标准曲线（HPLC)

2.5 腺嘌呤壳聚糖纳米粒对肿瘤细胞增殖的影响

药物浓度10ug/mL，72h细胞生长抑制率 =（A对照-A加药）/A对照×100%=（1.273～1.026）/1.273×100%=19.4%。

图3 腺嘌呤壳聚糖纳米粒对肝癌细胞增殖的影响

3.结论

通过离子凝集法制备壳聚糖空白纳米粒，测定其粒径分布及zeta电位，并在此基础上，以腺嘌呤作为药物模型，壳聚糖作为载体，三聚磷酸钠为阴离子，利用阴阳离子间的静电相互作用，成功制备了壳聚糖载腺嘌呤纳米粒。在壳聚糖空白纳米粒制作过程中，壳聚糖和TPP的浓度、温度、搅拌速率等对粒径大小产生一定的影响，经过实验得出在Ade=5mg/ml，TPP=8mg/ml，反应体系PH=5.5，温度为25℃，转速500r/min时，制备的壳聚糖载腺嘌呤纳米粒最佳，纳米粒粒径约为177.6nm，粒径较小，分散均一，Zeta电位为27.4mV，载药纳米粒稳定。腺嘌呤壳聚糖纳米粒对肿瘤细胞增殖有一定的抑制作用。