妇科再造丸含药血清对人子宫肌瘤细胞Bax和Bcl-2蛋白表达的影响*

胡颖， 罗俊， 张晴， 叶兰， 胡晓燕， 郑涛

(1.贵州医科大学 基础医学院 药理学教研室， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 基础医学院 机能学实验室， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州医科大学附院， 贵州 贵阳 550025； 4.贵州中医药大学第一附属医院， 贵州 贵阳 550001)

子宫肌瘤起源于子宫平滑肌细胞，多见于30～50岁女性，发病率高达20%～25%，是女性生殖器中最常见的良性肿瘤，也是未绝经妇女行子宫全切术的最主要原因，严重威胁着女性的身心健康[1-3]。目前多采用激素类药物治疗子宫肌瘤，但副作用大，停药后易复发，治疗效果并不理想[4～6]，因此临床上采用中药辅助治疗子宫肌瘤，取得了较满意的疗效[7-8]。妇科再造丸(Fu Ke Zai Zao pill，FKW)系贵州名医王聘贤所创，至今已有70多年的历史，具有活血化瘀、行气止痛、益气健脾之功效，临床广泛用于月经不调、痛经、体虚带下和妇科炎症等妇科疾病，对子宫肌瘤症状亦具有缓解作用。本课题组前期研究显示FKW对于雌、孕激素诱发的大鼠子宫平滑肌瘤样增生有显著的抑制作用，并能促进体外培养人子宫肌瘤细胞的凋亡[9-13]。有研究表明，细胞凋亡调控基因表达异常是子宫肌瘤发生、发展的重要因素之一，其中B细胞淋巴瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族起着重要的作用[14]，然而目前FKW促进子宫肌瘤细胞凋亡相关机制的研究尚未见报道。因此，本研究通过血清药理学方法，观察FKW对体外培养人体子宫肌瘤细胞凋亡相关蛋白Bcl-2及Bax表达的影响，探讨FKW促进子宫肌瘤细胞凋亡可能的作用机制，为临床应用增加新的适应症提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1标本来源 选择2015年1月-2017年4月因子宫肌瘤行子宫全切或肌瘤剔除术的患者4例，35～50岁，未绝经，术前3个月无类固醇激素使用史，术后经病理学诊断为子宫肌瘤。

1.1.2实验动物 清洁级3月龄Sprague Dawley(SD)大鼠，雌性，体质量(200±20)g，合格证号SCXK(黔)2012-0001，由贵州医科大学实验动物中心提供。

1.1.3药物、主要试剂与仪器 FKW(棕褐色丸剂，2.6 g/10丸，贵阳德昌祥药业有限公司生产，批号20151021)，桂枝茯苓胶囊(Gui Zhi Fu Lin capsule, GZFL，连云港康缘制药股份有限公司生产，批号150106)；Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培养基(美国Hyclone公司)，胎牛血清(美国Hyclone公司)，二甲基亚砜和胰蛋白酶(美国Sigma公司)，鼠抗人Bcl-2单克隆抗体和兔抗人Bax单克隆抗体(美国CST公司)，单克隆兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体和兔抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(英国Abcam公司)；CO2恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)，QL-901旋涡振荡器(海门市麒麟医用仪器厂)，Mini型蛋白电泳系统(美国Bio-rad公司)及LG2000数码凝胶图像分析系统(杭州朗基科学仪器有限公司)。

1.1.4标本及药品制备 术中无菌条件下取子宫肌瘤组织1 cm3，加入3%双抗(青、链霉素)的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)10 mL ，冰浴密闭尽快送入细胞培养室。FKW试验前用蒸馏水配制成高剂量组药液(终浓度112 g/L)，再依次稀释配制成中、低剂量组药液(终浓度分别为56、28 g/L)；GZFL临用前用蒸馏水配制成浓度为30 g/L混悬液。

1.2 方法

1.2.1给药和制备血清 取SD大鼠60只，随机分为空白组(无药血清组)、FKW低剂量组(28 g/L)、中剂量FKW组(56 g/L)、高剂量FKW组(112 g/L)及GZFL组，每组12只。无药血清组大鼠每次灌服生理盐水10 mL/kg，FKW高、中、低剂量组每次灌服相应药液10 mL/kg(分别为成人等效剂量12.9倍、6.5倍、3.2倍)，GZFL组每次灌服混悬液10 mL/kg(为成人等效剂量6.4倍)。各组大鼠给药2次/d，间隔6 h，连续2 d，第3天末次给药1 h后股动脉取血，分离血清，56 ℃、30 min灭活，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后分装，-20 ℃保存备用。

1.2.2人子宫肌瘤细胞的原代培养及鉴定[15]无菌条件下用3%双抗PBS液漂洗肌瘤组织，眼科剪将标本剪碎为1 mm3组织块，间距2～3 mm摆放于培养瓶中，置于37 ℃的5% CO2培养箱内，吸出培养液，翻转培养瓶使瓶底朝上后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养4 h后将培养瓶翻正培养，每2～3天换液1次，约3～4周出现致密细胞层后取出组织块，继续培养、传代，传代细胞均经α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-actin)免疫细胞化学法鉴定证实。

1.2.3Western Blot检测人子宫肌瘤细胞中Bax、Bcl-2的蛋白表达 实验分为无药血清组(加入20%无药血清)、FKW低、中、高剂量组及GZFL组(加入20%含药血清)。收集经药物干预72 h的各组子宫肌瘤细胞，PBS洗涤2次，裂解液冰上常规裂解30 min，12 000 r/min离心20 min，加入蛋白质上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，行SDS-PAGE电泳。电转法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，常温下浸于5%脱脂牛奶，水平摇床上封闭2 h后加入一抗(鼠抗人Bcl-2单克隆抗体1 ∶1 000，兔抗人Bax单克隆抗体1 ∶1 000，单克隆兔抗GAPDH抗体1 ∶1 000)，4 ℃摇床上孵育过夜，含吐温-20 ℃的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBST)洗涤PVDF膜5 min×6次，加入1 ∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育2 h，PBST洗膜5 min×6次，用ECL显色试剂盒显色，PVDF膜放入Bio-Rad图像摄取系统，保存图像。用LG2000数码凝胶图像分析系统进行条带光密度分析，计算目的蛋白吸光度与GAPDH吸光度的比值，作为目的蛋白的相对表达水平。每个样本重复测量3次。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 人子宫肌瘤细胞原代培养及鉴定

人子宫肌瘤细胞培养至第7～10天组织块边缘开始有细胞游出，随着时间延长细胞逐渐分裂，最终融合成片；胞体细长，为梭形或不规则三角形，呈放射状或旋涡状生长，当细胞生长接近铺满瓶底80%时传代，传代周期约3～5 d，传至3～5代的细胞形态均一，生长良好，经α-actin单克隆抗体免疫细胞化学染色证实，阳性细胞数接近100%，说明培养的肌瘤细胞纯度较高，符合要求，可用于后续的实验观察。见图1。

注：箭头处为肌瘤细胞(棕黄色)

2.2 子宫肌瘤细胞Bax、Bcl-2蛋白表达

实验结果显示，与无药血清组比较，FKW含药血清各剂量组均能增加Bax蛋白相对表达量，降低Bcl-2蛋白相对表达量(P<0.05或P<0.01)，且作用随剂量的增加有增强的趋势(P<0.05或P<0.01)。见图2。

注：与无药血清组比较,(1)P<0.01，(2)P<0.05；与FKW低剂量组比较,(3)P<0.01，(4)P<0.05；与FKW中剂量组比较，(5)P<0.01，(6)P<0.05。

3 讨论

肿瘤是细胞增殖和死亡均发生了异常的疾病[16]。实体肿瘤细胞的死亡主要有坏死和凋亡两种形式，一般认为，细胞凋亡抑制在肿瘤发生和发展过程中比细胞过度增殖起的作用更为重要[17]。细胞凋亡是有核细胞在凋亡基因调控下发生的细胞自我消亡的过程，是一种主动的、固有的程序化现象[18]。细胞凋亡一旦受到抑制，这部分通过“非法途径”得以存活的细胞将持续异常“发展”，进而形成局在型肿物[19]。研究表明，Bcl-2基因家族在细胞凋亡的基因调控网络中起着关键作用[20]。Bcl-2家族成员含有1～4个同源结构域，现已至少发现19个同源物，根据蛋白在细胞凋亡中的功能可将Bcl-2家族分为两类：一类是抗凋亡的，如Bcl-2、Bcl-xl、Ced-9、Mcl-1等，另一类是促凋亡的，如Bax、Bcl-xs、Bak、Bad等[21]。其中，Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最具代表性的功能相互对立的凋亡调控基因[22]。Bcl-2来源于B细胞淋巴瘤，被发现于B 细胞滤泡性淋巴瘤染色体断裂点，是凋亡抑制基因，在细胞中高表达时可对抗细胞凋亡、延长细胞寿命，故亦被称为“长寿基因”；Bcl-2蛋白是一种膜蛋白，位于线粒体膜，滑面内质网膜及核膜上，可通过抗氧化通路、影响Ca2+内流等多种机制抑制细胞凋亡[23]。Bax与Bcl-2有21%的同源性，主要的生物学功能是加速细胞凋亡，具有抑制肿瘤作用，Bax编码的Bax蛋白可与Bcl-2形成二聚体来发挥作用[24]。二者结合可形成Bcl-2/Bcl-2、Bcl-2/Bax和Bax/Bax 三种二聚体形式，其中同二聚体Bax/Bax促进细胞凋亡，Bcl-2/Bcl-2则抑制细胞凋亡，当二者形成异二聚体Bcl-2/Bax时，Bax与Bcl-2就会相互对抗、彼此制约，因此二者对细胞凋亡形成正负调控，各自在细胞内所占的比例是调节细胞凋亡的重要因素[25]。子宫肌瘤的发病机制与细胞凋亡关系密切[14]。研究发现，Bcl-2蛋白在子宫肌瘤标本中强阳性表达，在正常子宫肌层中弱阳性表达；Bax蛋白在正常子宫肌层中强阳性表达，在子宫肌瘤标本弱阳性表达，Bcl-2/Bax在子宫肌瘤组织中的表达显著高于正常[26-27]。因此，Bax表达水平过低、Bcl-2表达水平过高是子宫肌瘤发生发展的分子基础。

本研究成功建立人子宫肌瘤细胞原代培养并传代，可用于后续的实验观察，结果显示FKW含药血清各剂量组作用72 h后，子宫肌瘤细胞Bax蛋白相对表达量增加，Bcl-2蛋白相对表达量降低，与无药血清组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，且作用随剂量的增加有增强的趋势(P<0.05或P<0.01)，提示FKW促进子宫肌瘤细胞凋亡的作用与Bcl-2家族密切相关，即FKW可上调Bcl-2家族中抗凋亡成员Bcl-2的表达并降低促凋亡成员Bax的表达，从而Bax/Bax结合的同二聚体减少，Bcl-2/Bax结合的异二聚体相对增多，进而对子宫肌瘤细胞凋亡实现正调控。FKW是否还具有Bcl-2家族外的调控机制促进子宫肌瘤细胞凋亡，还有待进一步深入研究。此外，由于FKW由42味中药组成，组方及作用机制复杂，药理活性的发挥可能是源于FKW组方中特有的成分，也可能是各组分相互作用后的产物，或者是其在体内复杂的药物代谢过程中所产生的代谢物质，其具体发挥效应的成分亦有待进行进一步深入研究。

综上所述，FKW可通过影响细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达，促进子宫肌瘤细胞凋亡，抑制肌瘤生长。