互叶白千层精油的研究进展

宋吉明，吴江敏，朱泽华，魏泽伟，王 涛

(1.安徽大学 化学化工学院，安徽 合肥 230601；2.深圳市润昇源生物科技有限公司, 广东 深圳 518000)

茶树精油(tea tree oil，简称TTO)是从互叶白千层的鲜叶和茎中提取的，提取出来的精油为无色至淡黄色的透明液体，具有特殊芳香气味[1].目前通常采用水蒸气蒸馏法提取TTO，GC-MS数据分析表明TTO成分有60多种，其主要成分为松油烯-4-醇、-松油烯、-松油烯等.TTO的国际标准(ISO 4730-2004)规定了松油烯-4-醇等15种组分的含量范围，其中松油烯-4-醇含量不低于30%，1,8-桉叶素含量不高于15%；欧洲标准(AS 2782-1976)规定松油烯-4-醇含量不低于35%，1,8-桉叶素含量不高于10%；我国2011年颁布了TTO的国家标准(GB/T 26514)，规定松油烯-4-醇含量不低于30%，1,8-桉叶素含量不高于5%.选择合适的提取方法，在很大程度上决定了精油质量[2-3]，因此有必要研究不同的提取工艺来提高精油的品质，目前，除了传统的水蒸气蒸馏法外，溶剂萃取、超临界流体萃取等方法也被应用到TTO的提取中.另外，由于TTO具有多种药用活性，使得TTO得到了越来越广泛的开发与应用，目前，TTO已经应用于医疗、日用化妆品、水果保鲜、香料等行业.由于TTO成分复杂，随着研究者们对其进一步的开发，未来其应用范围会越来越广泛，也将得到越来越多的消费者的青睐.

1 茶树精油的提取

TTO目前提取的方法主要有水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、吸附法、超临界流体萃取法等[4]，由于各项提取技术都有自己的特点和适用范围，实践生产中应当根据茶树(产地)的特征来选择合适的提取工艺.

1.1 水蒸气蒸馏法

水蒸气蒸馏法是目前最常使用的TTO提取方法.将互叶白千层茎叶粉碎，润湿一定时间后，通入一定量的水蒸气进行蒸馏，精油随着蒸气一同挥发出来，经冷凝后进行油水分离得到TTO.弓宝等[5]研究了TTO的提取条件，结果表明，互叶白千层粉碎至10目筛，加入互叶白千层6倍水量润湿，浸泡4 h后，提取4 h，总得率在2.5%以上.翁晓晨等[6]研究了蒸馏压力对TTO品质的影响，随着蒸馏压力的增加，TTO的颜色由无色变为浅黄色，而蒸馏压力的变化将导致其成分的变化，当提取压力达到0.20 MPa时，TTO的主要成分基本达到国家标准.因此，适当提高蒸馏压力可以提高TTO的质量.Huynh等[7]在水蒸气蒸馏的基础上对TTO进行纯化，主要运用分子蒸馏的方法，结果显示1,8-桉叶素含量降低，松油烯-4-醇含量提高.

1.2 溶剂萃取法

溶剂萃取法中，萃取溶剂的选择决定了提取精油质量的优劣，常用的溶剂有乙醇、石油醚、乙醚，萃取时常采用搅拌、加热回流、微波等辅助手段，萃取后取滤液，减压蒸馏得到浓缩液或浸膏[8].田玉红等[9]用乙醚对水蒸气蒸馏后的残液进行萃取，经过GC-MS分析，确认了61种化学成分，其主要组分为松油烯-4-醇、α-松油醇、1,8-桉叶油素.Baker等[10]定量地比较了微波辅助乙醇提取和水蒸气蒸馏技术在TTO提取中的差异，结果表明，对于低油和高油浓度的互叶白千层原料，采用乙醇为溶剂，提取率分别为4.8% 和7.7%，这比同一原料在2 h内水蒸气蒸馏的提取率分别高出14%和22%；另外，将蒸馏时间延长至6 h，提高了倍半萜类化合物的回收率，但会导致单萜类化合物、松油烯-4-醇和1,8-桉树脑的含量降低，其原因可能是更多疏水性分离物在冷凝物中溶解.由于溶剂萃取法能更多地保留茶树中原有的组分，因此更适用于研究TTO中所含有的全部组分.

1.3 超临界流体萃取法

超临界流体萃取(supercritical fluid extraction,简称SFE)分为萃取、从溶剂中分离溶质两个主要步骤.为了进行SFE，使流体处于超临界状态，流体通常在进入提取器之前依次加压和加热，然后在提取器中萃取基质里的溶质，最后分离溶质，超临界流体再次变为气态，可回收循环使用[11].图1为CO2超临界流体萃取装置图.

图1 超临界流体萃取装置的图解(资料来源于文献[12])

许静等[13]用超临界CO2萃取茶树花精油，最佳提取条件为：萃取压力19～22 MPa，静态萃取时间30～50 min，萃取温度30～50 ℃、动态萃取时间80～100 min，分离温度40～50 ℃.Wong等[14]研究了提取TTO中8种单萜的最佳提取工艺条件，结果表明，在温度110 ℃、CO2密度为0.25 g·mL-1的条件下，单萜的回收率最高.由于超临界流体萃取纯度高，且流体可循环利用，未来其应用范围会越来越广泛.

2 药理活性

2.1 抗细菌活性

TTO具有广谱抗菌性，包括抗金黄色葡萄球菌、变形链球菌和大肠杆菌等多种细菌及真菌[15].Zhang等[16]研究了TTO对大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，用0.1 mL的TTO浸泡直径6 mm的纸盘，并置于固体培养基平板的表面，用测试中的3种不同微生物接种.通过测量盘周围的生长抑制区来记录每种微生物晕圈的大小，结果显示金黄色葡萄球菌抑制区直径为(26±2.80) mm，大肠杆菌抑制区直径为(12±1.63) mm，铜绿假单胞菌抑制区直径为(10±0.94) mm，表明TTO对这3种菌体都有一定的抑制作用.Kang等[17]研究了TTO对变形链球菌的抗性，对照组仅用盐水溶液，实验组各给予不同体积浓度的TTO，分别为30%和50%(用盐水制备的TTO体积浓度)，通过计数单位体积中微生物的群落总数(CFU)来确定抗菌作用.结果储存在生理盐水中的标本CFU为5×104，在TTO体积浓度为30%的条件下CFU为65±43，在TTO体积浓度为50%的条件下CFU为40±37，实验表明，对照组细菌数量大于实验组，实验组溶液对变形链球菌具有较好的抗性.研究人员考察了TTO对金黄色葡萄球菌的抑制效果，结果显示TTO对金黄色葡萄球菌悬浮菌的最低抑菌浓度(MICs)范围在1～2 mg·mL-1之间，最小杀菌浓度(MBCs)的范围则在2～4 mg·mL-1之间，说明TTO对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性[18].为了进一步探究TTO的抗菌机制，Li等[19]通过TTO处理微生物菌株，并且用TEM图像观察内部形态.在对照条件下培养的大肠杆菌细胞显示出典型的杆状，细胞膜和细胞质都是规则的，细胞壁和细胞质膜紧密结合；相反，用TTO培养的大肠杆菌细胞的内部形态被改变，细胞质膜和细胞壁之间存在很大的间隙，此外，观察到质壁分离和细胞质膜的部分消失.Li等[19]又用相同的方法对金黄色葡萄球菌细胞进行实验，观察到细胞质膜与细胞壁的局部分离；因此，可以得出结论，TTO可能穿透并破坏测试中的细菌的细胞壁和细胞质膜，最终，这些不可逆转的损害导致微生物细胞死亡.综上所述，TTO的抗菌机制可能与细胞质及其细胞内部结构的破裂有关.

2.2 杀虫活性

TTO除了具有优异的抗菌活性外，还具有一定的杀虫活性.Liao等[20]使用300 mL玻璃瓶作为熏蒸室，将总共30个随机选择的玉米象(Sitophiluszeamais)成虫放入每个玻璃瓶中，将精油滴加到滤纸上，该滤纸附着在罐盖的下表面一侧，随后，将玻璃罐保持在上述培养条件下，以没有使用精油处理的玻璃罐作为对照，在处理24，48，72 h后记录昆虫的死亡率.实验数据显示(表1)，在相同剂量11.97 mg·L-1精油的条件下，24，48，72 h精油空气导致玉米象成虫的死亡率分别为82.22%，85.56%，92.04%；相应地，半数致死浓度(LC50)值分别为8.42，7.70，6.78 mg·L-1，这些结果证明了TTO对玉米象成虫具有较好的熏蒸毒性.Liao等[21]研究了TTO对棉铃虫的毒性，通过直接接触暴露的棉铃虫幼虫，在最大剂量为40.00 mg·mL-1的条件下，幼虫在24，48，72 h的死亡率分别为73.33%，90.00%，93.33%，通过增加精油剂量，精油的接触毒性也明显增强.另外，比较了暴露时间分别为24，48，72 h精油的半数致死量(LD50)值分别为50.28，34.44，29.10(单位：微克/幼虫)，结果表明TTO对棉铃虫有较强的抑制作用.姚陈霞等[22]研究了TTO对扶桑绵粉蚧昆虫的抗性机制，实验过程显示，昆虫出现了痉挛，接着麻痹、兴奋，最后直至死亡4个阶段，而且体表会失水破裂，这在一定程度上解释了TTO抗虫活性的机制.

表1 互叶白千层精油对玉米象的熏蒸毒性

2.3 抗氧化作用

单萜α-萜品烯用作香料化合物存在于不同的精油中，是TTO的一个重要组成部分.Rudbäck等[23]证实了α-萜品烯是结构上类似于能够自动氧化的单萜，并探讨了α-萜品烯在空气中暴露的致敏效力和α-萜品烯的氧化产物形成过程.使用节点测定法测定小鼠局部淋巴，分析表明α-萜品烯迅速地降解，主要的氧化产物为烯丙基环氧化物、对甲基异丙基苯和过氧化氢.从化学性质来看，α-萜品烯是一种真正的抗氧化剂，它能够迅速自动氧化，从而阻止其他化合物发生降解.吴克刚等[24]研究了植物精油(包括茶树精油)清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的实验，固定精油量0.05 μL·mL-1，在室温下25 ℃左右反应60 min，研究了TTO、茴香油和桉叶油等12种挥发油对DPPH自由基的清除效果，结果表明，除了丁香精油、甘牛至油、肉桂精油外，TTO对DPPH自由基的清除率最高，清除率为27.63%，说明TTO具备较好的抗氧化能力.

2.4 抗癌活性

松油烯-4-醇作为TTO主要活性成分，在抗癌方面有显著的药理活性.Shapira等[25]研究了松油烯-4-醇的抗肿瘤作用及其在前列腺和胃肠道恶性肿瘤中的作用机制，对照组采用联合标准化疗(奥沙利铂、氟尿嘧啶等)，实验组单独给予松油烯-4-醇在治疗结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌和前列腺癌细胞后，通过光学显微镜定性测量杀伤效应并用流式细胞仪(FACS)定量测量，实验表明，松油烯-4-醇使上述癌细胞生长受到抑制，并且随着松油烯-4-醇剂量的增加，其抑制癌细胞生长效果更好,同时，松油烯-4-醇和各种抗癌剂(0.2 μM奥沙利铂和0.5 μM氟尿嘧啶)联合使用显示出对癌细胞增殖的协同抑制作用(分别为83%和91%)，松油烯-4-醇显著增强了几种化学治疗的效果，表明松油烯-4-醇的分子作用机制可能涉及诱导细胞死亡，使该化合物单独作为潜在的抗癌药物并且在治疗多种恶性肿瘤中组合使用.Nakayama等[26]研究了松油烯-4-醇对结肠直肠癌的生长抑制作用，取人结肠癌细胞系(HCT116和RKO)和人正常结肠上皮细胞系(CCD841 CoN)做对比,为了评估松油烯-4-醇对细胞活力和增殖的影响，进行了水溶性四唑盐(WST-8)和溴脱氧尿苷(BrdU)测定，数据显示松油烯-4-醇显著降低人结肠癌细胞系HCT116存活率的浓度为100 μM，降低RKO存活率的浓度为1 000 μM,另外HCT116和RKO细胞中松油烯-4-醇的IC50值分别为661，381 μM；相反，松油烯-4-醇在正常人结肠上皮细胞系(CCD841 CoN)中的IC50值为5 347 μM，表明松油烯-4-醇能抑制结肠癌细胞的增殖.

2.5 其他活性

TTO除了以上几种主要的药理活性外，还有抗炎、防腐、抗病毒、麻醉等药理作用.Souza等[27]评估了几种麻醉剂对短尾亚目甲壳动物蟹的有效性和安全性，分别提取白棘枝(Lippiaalba)、锥叶芦荟(Aloysiatryphilla)、互叶白千层的精油，从精油中分离的主要化合物分别为丁子香酚、薄荷醇和松油烯-4-醇，将丁子香酚、薄荷醇、松油烯-4-醇和TTO的纳米包封形式分别加入水中(浸泡)，通过注射或口服强饲法，与其他甲壳类动物麻醉剂相比，只有TTO和丁子香酚通过短时间的浸泡诱导麻醉具备长时间的麻醉效果.另外，在短尾亚目甲壳动物蟹中注射松油烯-4-醇和纳米包封的TTO，观察到良好的麻醉效果，表明丁子香酚、松油烯-4-醇和TTO是甲壳类动物麻醉剂的潜在替代品.

3 应用开发

TTO作为一种天然的抗菌、抗癌、抗氧化物质，在临床上得到了广泛应用，具有良好的开发前景.

3.1 用于痤疮、疥疮等皮肤疾病

TTO临床上对痤疮的主要作用方式包括抗菌作用(过氧化苯甲酰和抗生素)、抗炎活性(类维生素A)、滤泡角质正常化(类维生素A)、皮脂分泌减少(类维生素A)，到目前为止，TTO只展示了前两种作用方式[28].Malhi等[29]评价了TTO凝胶和洗面奶对脸部痤疮的功效、耐受性和可接受性.在这项实践中，参与人员每天2次将TTO产品涂于面部，持续12周，并在4,8,12周后进行评估，功效由面部痤疮病变的总数确定；通过不良事件的频率来评估耐受性；研究期结束时通过问卷评估产品可接受性，结果如下：共招募了18名参与者，其中14人完成了研究，平均总病变计数在基线时为23.7，在4周时为17.2，在8周时为15.1，在12周时为10.7，这些数据支持以前的研究结果，即TTO产品可减少病变数量，并且在用于治疗轻度至中度面部痤疮时具有良好的耐受性.与商业制剂相比，TTO已经显示出对一系列医学和兽医害虫的杀虫、杀螨和驱虫效果[30]，TTO的杀螨、抗菌、止痒、抗炎和伤口愈合作用，在一定程度上表明TTO能成功减轻疥疮感染和相关的细菌并发症[31].

3.2 开发为消毒剂

研究发现，TTO对多种菌体均具有良好的抗性，如放线菌、棒状杆菌、肠球菌、链球菌、假丝酵母、镰刀菌属等[32].因此，可以通过研究TTO对细菌的抗性来开发一些纯天然消毒剂，这种环境友好型消毒剂具有相当好的应用前景.

3.3 用于水果保鲜

由于TTO良好的抗菌活性和抗氧化作用，已越来越多地用于水果的保鲜，同时，TTO对环境的无毒无污染，也进一步加大了其应用价值.邵兴锋等[33]研究了TTO对草莓保鲜的最佳工艺，结果表明，其最佳工艺为熏蒸温度33.3 ℃、时间3.1 h、体积分数0.66 mL·L-1，腐烂指数为7.5%.李远颂等[34]研究了壳聚糖和植物精油复合保鲜液对圣女果的影响，结果表明，0.049%TTO+0.5%吐温+1.5%无水乙醇+1%羧化壳聚糖-80组成的保鲜剂体系能够较好地抑制圣女果的腐烂，减少营养成分的损失，延长圣女果的保鲜时间,具有较好的保鲜性能.

3.4 研制成复合制剂

由于TTO在抗菌、抗病毒等方面的重要价值，TTO也得到了越来越广泛的应用，其中包括微胶囊、微球、凝胶、纳米乳液等复合制剂.Ghaemi等[35]引入了一类新的工程纳米体系，茶树精油纳米乳(TTO NE)负载Ag纳米颗粒(NPs)，抗菌测定的结果显示，设计的纳米体系用于根除革兰氏细菌的能力为95%，表明TTO-NE可作为治疗局部细菌感染的抗微生物剂.林冠全等[36]通过在P(St-BMA)微球上吸附TTO制备茶树精油微球，研究了微球的吸油和缓释性能，结果表明，TTO微球形成过程中，P(St-BMA)微球的表面由初始凹形态变为凸形态，TTO微球显著提高了TTO的稳定性，在自然释放13 h后，与TTO相比，TTO微球的抗菌效果明显改善.Santos等[37]研制了茶树精油纳米粒，在该研究中，评价了茶树精油纳米颗粒对类芽孢杆菌属(Paenibacillus)物种(包括幼虫芽孢杆菌P.larvae)和蜂房蜜蜂球菌Melissococcusplutonius菌株的体外抗微生物活性,TTO记录的MIC值为0.18%～6.25%，而茶树精油纳米颗粒的MIC值为0.01%～0.93%，研究结果首次显示TTO纳米包封对类芽孢杆菌属物种和蜂房蜜蜂球菌菌株具有高活性，表明纳米技术的使用可能是治疗或预防美洲幼虫腐臭病、欧洲幼虫腐臭病的另一种替代方法.综上可知，通过物理或化学方法，将TTO包装成复合制剂，不仅能防止其挥发，而且能大幅提高其药用活性.

4 发展现状及展望

TTO在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等方面均展现良好的前景，然而，国内在茶树这一方面的研究不是很深入，依然存在很多问题：首先，互叶白千层在国内种植数量有限，TTO在国内未得到推广；其次，不同产地的TTO，由于地理环境的差异导致其组分的不同，进而影响其药理活性；第三，TTO在临床上尚未得到广泛的应用，在化妆品开发中处于初始阶段，相关的技术还不是很完善.未来对互叶白千层进行开发应用研究应集中在以下3个方面：第一，对互叶白千层进行综合开发利用，包括互叶白千层黄酮、精油、多糖的提取和分离；第二，寻求合适的精油提取工艺，降低生产成本，提高生产效益；第三，利用物理或化学方法，制备TTO复合制剂，提高TTO的药理活性.