土壤真菌Tolypocladium sp.HU35P-2次级代谢产物化学成分的研究

王 玎，白 雪

（1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110016；2.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

土壤真菌，属于陆生真菌，是以土壤为生存场所，完成全部或部分生活史的真菌。土壤真菌次级代谢产物种类多样，结构新颖，具有抗肿瘤、抗真菌、抗病毒等生物活性，是新药以及新的先导化合物的重要物质来源[1-2]。从云南大围山土壤样品中分离得到一株真菌HU35P-2，并通过体外抗肿瘤试验确定其具有较好的生物活性，依据菌落形态特征及ITS rDNA测序分析方法鉴定为Tolypocladium sp.HU35P-2，为寻找新药的先导化合物，对其次级代谢产物化学成分进行分离和研究，得到4个化合物，根据其理化性质并综合运用波普技术，鉴定这4个化合物分别为格链孢酚（alternariol，1）、β-adenosine（2）、ergosterol（3）、β-胡萝卜苷（4）。其中，化合物1 为首次从弯颈霉属中分离得到。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SPD-10A紫外检测器；Bruker-ARX-400 型核磁共振仪；Bruker AV-600 型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；Shimadzu LC-10ATvp 型分析型高效液相色谱仪；Shimadzu LC-8A 型制备型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；薄层色谱硅胶和柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；Sephedex LH-20（瑞典Pharmacia Biotech公司）。

1.2 试药

分析纯甲醇，乙酸乙酯，二氯甲烷，正丁醇，丙酮（广州化学试剂厂）；色谱纯甲醇，乙腈；氘代试剂（美国CIL公司）。

2 提取分离

将大米培养基捣碎后，加入等体积的95 %乙醇，超声40 min浸泡，提取液减压浓缩后放置通风处挥发。用等体积的乙酸乙酯，正丁醇各萃取3次，浓缩提取液，得26 g乙酸乙酯萃取物，17 g正丁醇萃取物，乙酸乙酯层萃取物经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100:0→0:100）梯度洗脱，得到3个馏分，经过反复硅胶柱色谱（氯仿-甲醇系统洗脱）、Sephadex LH-20柱色谱（甲醇-水系统洗脱）、制备HPLC（乙腈-水、甲醇-水系统洗脱）进行分离纯化，得到化合物1～4（见图1）。

图1 化合物1～4结构式

3 结构鉴定

化合物1：白色粉末（甲醇），紫外254 nm下明显暗斑。1H-NMR（400 MHz， DMSO-d6）谱中δH11.8（1H，s，OH-3）为一活波氢信号；4个芳香氢质子信号δH6.36（1H，d，J=1.7 Hz，H-4），6.63（1H，d，J=2.3 Hz，H-3’），6.71（1H， d，J=2.3 Hz，H-5’），7.24（1H，d，J=1.7 Hz），δH2.70（3H，s，H-7’）为一甲基质子信号。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）中δC164.0（C-7）显示有一个酯羰基碳信号，δC164.7（C-5），165.4（C-3），158.4（C-4’），152.6（C-2’），138.3（C-6’），138.1（C-1），117.5（C-5’），108.9（C-1’），104.3（C-6），101.6（C-3’），100.9（C-4），97.4（C-2）为苯环上芳香碳信号，提示含有两个间位取代苯环片段，δC25.2 （C-7’）为甲基碳信号。综合以上信息，结合文献[3]，鉴定该化合物1为alternariol；化合物1碳氢信号归属见表1。

表1 化合物1的1H-NMR 和13C-NMR 数据（DMSO-d6）

化合物2：白色粉末（甲醇）。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）谱中，特征性氢质子信号δH8.36（1H，s，H-8），8.14（1H，s，H-2），7.36（2H，s， NH2-6），结合13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）谱中，δC156.1（C-2），152.4（C-6），149.1（C-4），139.9（C-8），119.3（C-5），推测存在腺嘌呤结构；δH5.88（1H，d，J=6.3 Hz，H-1’），4.61（1H，dd，J=11.4，6.3 Hz，H-2’），4.14（1H，m， H-3’），3.96（1H，m，H-4’），3.67（1H，m，H-5’b），3.55（1H，m，H-5’a）和δC88.0（C-1’），86.0（C-4’），73.6（C-2’），70.8（C-3’），61.8（C-5’）信号，推测结构中存在核糖结构。综合以上数据，结合文献[4]，确定化合物2为腺嘌呤核苷。

化合物3：无色结晶（二氯甲烷）。紫外254 nm下显示明显暗斑，10 %硫酸乙醇溶液（v/v）显色呈现墨绿色。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）给出6个甲基质子信号δH1.04（3H，d，J=6.6 Hz），0.95（3H，s），0.92（3H，d，J=6.8 Hz），0.84（3H，d，J=6.3 Hz），0.82（3H，d，J=6.5 Hz），0.63（3H，s）推测该化合物为甾体类。此外氢谱中δH5.20（2H，dd，J=15.2，6.9 Hz）为侧链C-22，23位反式双键的特征氢信号，δH5.57（1H，dd，J=5.4，2.6 Hz），5.38（1H，dt，J=5.4，2.6 Hz）为烯氢信号。δH3.63（1H，m）为3位连氧的特征氢信号。以上氢数据，与文献[5]对比一致，确定该化合物3结构为ergosterol。

化合物4：无色结晶（甲醇），紫外254 nm下显示明显暗斑，10 %硫酸乙醇溶液（v/v）显色呈现深墨绿色。1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）给出6个甲基质子信号δH1.0（3H，d，J=6.2 Hz），0.95（3H，s），0.89（3H，t，J=6.6 Hz），0.81（3H，d，J=6.8 Hz），0.79（3H，d，J=6.8 Hz），0.65（3H，s）推测该化合物为甾体类。此外氢谱中δH5.34 （1H，br s，H-6）为C-6双键氢信号；δH4.87 （1H，d，J=5.0 Hz，H-1’），4.42（1H，m，H-6’a），4.20（1H，m，H-3’），3.64（1H，m，H-5’）和3.46～2.86（m，葡萄糖中H）及结合13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）谱中，δC101.2，77.4，77.2，73.9，70.5和61.5提示含有葡萄糖片段。13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）中，δc 140.9，121.6，77.1，56.6，55.8，50.0，45.6，42.3，38.7，37.2，36.6，35.9，33.8，32.9，31.9，31.8，29.6，29.1，28.2，25.8，24.2，23.0，20.0，19.9，19.5，19.4，19.0，12.2，12.1证实化合物为甾体类；结合文献[6]，鉴定化合物4为β-胡萝卜苷。