正交优化微波提取补肝散中抗抑郁有效组分群的工艺

王嘉伟，王雪华，彭晓娉，于兹东，由翰林，姜含章，丁文琴，李英霞

（青岛大学 药学院 天然药物与生药学系，山东 青岛 266021）

补肝散为传统中药复方，由香附和夏枯草按2:1组成，具有行气泻火、清肝明目的功效，原方主要治疗肝郁火盛之症[1-2]。课题组前期发现该复方稀醇提取物的乙酸乙酯、正丁醇分离组份有明显的抗抑郁活性[3-4]，为复方抗抑郁作用的有效组分。化学定性预试结果表明，乙酸乙酯部位主要含有黄酮类等成分，正丁醇部位主要含有三萜皂苷类等成分。目前，对补肝散提取工艺的研究尚未见文献报道。本文采用微波提取新技术，以总黄酮和总皂苷为考察指标，对影响补肝散醇提工艺参数进行正交实验优选，并与超声法和回流法进行了比较，旨为今后进一步分离、纯化抗抑郁有效组分奠定前期基础。

1 材料与仪器

1.1 药物与试剂、试药

夏枯草饮片及香附饮片均购于青岛市健联药店，批号分别为160701和160601，前者产于河南，后者产于浙江，经青岛大学药学院生药学教研室李英霞教授鉴定，分别来源于唇形科植物夏枯草（Prunella vulgarisL.）的干燥果穗和莎草科植物莎草（Cyperus rotundusL.）的干燥根茎。

芦丁对照品和熊果酸对照品（二者纯度均≥98 %），购自成都德瑞可生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；MAS-Ⅱ微波提取仪（上海新仪微波化学科技有限公司）；RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHK-ⅢA循环水式多用真空泵（郑州科泰实验设备有限公司）；NVP-1000隔膜真空泵（上海埃朗仪器有限公司）；DK-S22电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；Centrifuge 5424高速离心机（德国Eppendorf）；SHZ-DIII型不锈钢循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；EYELA冷却水循环装置（上海爱朗仪器有限公司）；AL104电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-100DB数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

2 实验方法

2.1 样品溶液的制备

称取补肝散粉末（40～60目）3 g，置100 ml提取瓶，加入一定质量分数的乙醇60 ml，设定一定功率、辐射温度和时间进行微波提取。提取完毕，放冷，离心（3500 r/min），将上清转入100 ml量瓶，加一定体积分数的乙醇，定容至刻度，混匀，作为供试品溶液 。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线的绘制 精密吸取干燥至恒重的芦丁对照品适量，加甲醇溶解，配成浓度为0.102 mg/ml对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.2，0.5，1，2，3，4，6，8 ml，分别置入10 ml量瓶，分别加5 %亚硝酸钠溶液（NaNO2）0.3 ml,摇匀，静置6 min，加10 %硝酸铝溶液0.3 ml，摇匀，静置6 min，加4 %氢氧化钠溶液4 ml，加甲醇至刻度，摇匀，放置12 min，以上述显色剂同样操作，制备空白对照，用紫外-可见分光光度计于501 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程为Y=0.01105X-0.0150 （r=0.9994），表明芦丁在0.0204～0.8160 mg内线性关系良好。

2.2.2 样品溶液含量测定 精密量取不同供试品溶液2 ml，置入10 ml量瓶，分别按2.2.1项下方法加入显色剂，测定提取液中总黄酮的含量。

2.3 总皂苷含量测定

2.3.1 标准曲线的绘制 精密称取熊果酸标准品适量，加甲醇溶解配成浓度为0.11 mg/ml的对照品溶液。精密吸取对照品溶液0.2，0.4，0.5，0.6，0.7，1 ml置离心管中，蒸去溶剂后，加5 %香草醛冰醋酸溶液0.3 ml，浓硫酸1 ml，80 ℃水浴加热10 min，立即置冰浴中，冷却5 min，加冰醋酸5 ml，摇匀，以上述显色剂同样操作，制备空白对照采用紫外-可见分光光度计于547 nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，计算回归方程为Y=0.0458X-0.0401（r=0.9990），表明熊果酸在0.022～0.110 mg内线性关系良好。

2.3.2 样品溶液含量测定 精密量取不同供试品溶液2 ml，置入25 ml量瓶，加相应体积分数的乙醇，定容至刻度，取1 ml按2.3.1项下方法操作，测定提取液中总皂苷的含量。

2.3.3 总黄酮或总皂苷提取率=（提取液中总黄酮含量或总皂苷含量×提取液体积×稀释倍数）／补肝散质量×100 %。

2.4 单因素试验

2.4.1 乙醇体积分数对总黄酮和总皂苷提取率的影响 取补肝散粉末6份，每份6 g，分别加10 %，30 %，50 %，70 %，80 %和95 %乙醇60 ml，微波提取，固定微波功率600 W，提取时间10 min，辐射温度60 ℃，料液比1:10。提取完毕，放冷，离心，取上清按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2项下方法操作，测定总黄酮和总皂苷的含量及提取率。

2.4.2 提取时间对总黄酮和总皂苷提取率的影响取补肝散粉末5份，每份6 g，分别加50 %乙醇60 ml，微波提取5，10，15，20，30 min固定微波功率600 W，提取温度60 ℃，料液比1:10。提取完毕，放冷，离心，取上清按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2项下方法操作，测定总黄酮和总皂苷的含量及提取率。

2.4.3 提取温度对总黄酮和总皂苷提取率的影响 分别取补肝散粉末5份，每份6 g，分别加50 %乙醇60 ml，于40，50，60，70，80 ℃微波提取，固定提取功率600 W，提取时间15 min，料液比1:10。提取完毕，放冷，取上清液按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2项下方法操作，测定总黄酮和总皂苷的含量及提取率。

2.4.4 微波功率对总黄酮和总皂苷提取率的影响 分别取样品6份，每份6 g，分别加50 %乙醇60 ml，微波提取，分别设定功率200，300，400，500，600和700 W，固定提取时间15 min，温度60 ℃，料液比1:10。提取完毕，放冷，离心，取上清液按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2项下方法操作，测定总黄酮和总皂苷的含量及提取率。

2.4.5 料液比对总黄酮和总皂苷提取率的影响 分别取补肝散粉末4份，每份4.5 g，分别在提取瓶中加入料液比（g:ml）为8，10，15，20倍50 %乙醇微波提取，固定微波提取功率600 W，时间15 min，温度60 ℃。提取完毕，放冷，离心，取上清液按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2项下方法操作，测定总黄酮和总皂苷的含量及提取率。

2.5 正交试验

在单因素考察的基础上，固定料液比1:20，选取乙醇体积分数（A）、辐射温度（B）、微波功率（C）及提取时间（D）为试验因素，每个因素设计3个水平，选择L9（34）正交表（见表1）进行试验，并进行方差分析。

表1 因素水平表

2.6 验证性实验

按照正交实验优选出的工艺条件微波提取补肝散。另外采用超声法和传统回流法提取，超声提取条件与微波提取相同，回流法提取时间为2 h，其他条件与微波法一致，提取完毕，按上述2.1，2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2项下方法操作，测定总黄酮和总皂苷的含量及提取率。

3 结果与分析

3.1 乙醇体积分数对总黄酮和总皂苷提取率的影响

结果见图1。

图1 乙醇体积分数对总黄酮和总皂苷提取率的影响

由图1可见，乙醇体积分数从10 %升高至 50 %，总黄酮和总皂苷的提取率也随之提高。对于总黄酮，以50 %乙醇提取最高（2.160 %），而后提取率逐渐下降；对于总皂苷，以70 %乙醇提取的为最高（0.984 %），其次是50 %乙醇提取的（0.803 %），二者相差不大，综合考虑，初步选择以50 %提取。

3.2 辐射时间对总黄酮和总皂苷提取率的影响

结果见图2。

由图2可见，随提取时间延长（5 min至15 min），总黄酮和总皂苷的提取率均逐渐提高。对于总黄酮提取率，20 min为最高（2.957 %），30min略有下降；对于总皂苷提取率，15 min提取率最高（0.895 %），20 min至30 min，提取率有所下降，考虑15～20 min提取已完全，继续延长提取时间，皂苷类成分的结构可能会发生变化，综合考虑确定提取时间为15 min。

图2 辐射时间对总黄酮和总皂苷提取率的影响

3.3 辐射温度对总黄酮和总皂苷提取率的影响

结果见图3。

图3 辐射温度对总黄酮和总皂苷提取率的影响

由图3可见，提取温度升高，总黄酮和总皂苷的提取率也随之提高，至80 ℃提取率最高，再升高温度，药液易产生爆沸，故确定提取温度为80 ℃。

3.4 料液比对总黄酮和总皂苷提取率的影响

结果见图4。

由图4可见，随料液比的增大，总黄酮和总皂苷的提取率也逐渐提高，1:20为最高，故确定料液比为1:20。

3.5 微波功率对总黄酮和总皂苷提取率的影响

结果图5。

图4 料液比对总黄酮和总皂苷提取率的影响

图5 微波功率对总黄酮和总皂苷提取率的影响

由图5可见，微波功率从200 W升至700 W，总黄酮和总皂苷的提取率变化不明显。200 W总黄酮提取率略高，400 W总皂苷提取率略高，从能耗角度考虑，初步确定微波功率选择200 W。

3.6 正交试验结果

结果见表2 、表3。

由表2、表3直观分析和方差分析结果可见，A、B和D因素均为影响总黄酮提取率的显著性因素，C因素为次要因素；B因素为影响总皂苷提取率的显著性因素，其它因素为次要因素。对于B因素，温度升高，总黄酮和总皂苷的提取率也提高，故选择水平3，即辐射温度80 ℃；对于D因素，提取时间延长，总黄酮和总皂苷提取率也提高，故选择水平3，即提取时间15 min；A因素对总黄酮提取率的影响情况为：水平2（50 %乙醇）＞水平3（70 %乙醇）＞水平1（30 %乙醇），而对总皂苷提取率则为水平3＞水平2＞水平1，因A因素为总黄酮的显著性因素，综合考虑，选择水平2，即乙醇体积分数为50 %；对于C因素，总黄酮的提取率含量以水平1（200 W）的略高，而总皂苷提取率为水平2（400 W）＞水平1（200 W）＞水平3（600 W），因C因素为次要因素，综合考虑能耗等情况，确定微波功率为200 W。

根据以上试验结果，确定微波提取补肝散中总黄酮和总皂苷的最优工艺为乙醇体积分数50 %，辐射温度80 ℃，微波功率200 W，提取时间15 min。

表2 L9（34）试验方案及结果分析表

3.7 验证性试验结果

称取3批补肝散，按上述2.1， 2.2.1，2.2.2和2.3.1，2.3.2项下方法操作，测定其提取液中总黄酮和总皂苷的含量及提取率。 结果其总黄酮提取率分别为3.250 %，3.191 %和3.303 %，平均3.248 %，RSD为1.72 %；总皂苷提取率分别为1.547 %，1.558 %和1.591 %，平均1.565 %，RSD为1.46 %，均高于正交试验中的结果，说明优选出的工艺可行，稳定性良好。

表3 方差分析表

4 讨论与小结

微波提取具有提取时间短、效率高、能耗低、环保等优点，是一种新型的提取方法，近年在中药及天然药物的提取中得到愈来愈广泛的应用[5-10]。本文采用单因素考察与正交试验相结合的方法，对微波提取补肝散中总黄酮和总皂苷工艺进行了优选，确定的最佳工艺参数为：体积分数为50 %的乙醇，料液比1:20，微波功率200 W，提取温度80 ℃，提取时间15 min，验证试验结果稳定、可靠，可用于补肝散中黄酮类和皂苷类成分的提取。