UPLC指纹图谱结合化学模式识别评价白芷药材质量

陈 琳,唐志书,刘妍如,宋忠兴,孔馨逸,魏思敏,孙 琛,鞠 浩

1陕西省中药资源产业化协同创新中心 秦药特色资源研究开发国家重点实验室(培育) 陕西省创新药物研究中心，咸阳 712083；2陕西中医药大学药学院，西安 712046

白芷为伞形科植物白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F.var.formosana (Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，其性辛、温，归胃、大肠、肺经，始载于《神农本草经》[1]。临床应用广泛，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带、消肿排脓之功效，用于治疗感冒头痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、带下、疮痈肿痛等症[2]。

呋喃香豆素是白芷中的主要活性成分，《中国药典》2015年版规定白芷干燥品中含欧前胡素的含量不得少于0.08%[2]。除欧前胡素外，白芷中还含有水合氧化前胡素、异欧前胡素、白当归素、氧化前胡素、佛手柑内酯等呋喃香豆素成分[3,4]。现代药理学研究表明，白芷及其活性成分具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤以及抗心脑血管疾病等多种药理活性[5-9]。

四川、杭州、安徽、河南以及河北等地是白芷的主要产地，分别为川白芷、杭白芷、亳白芷、禹白芷和祁白芷，不同产地白芷的化学成分有较大差异[10]。除产地之外，加工方法是影响白芷药材质量的另一个重要因素，据报道，经硫磺熏蒸后，呋喃香豆素类成分的含量显著下降[11]，镇痛活性也显著降低，表明白芷活性成分易受产地、加工方式等的影响。目前对白芷质量控制的研究，主要集中在欧前胡素、异欧前胡素等几个呋喃香豆素成分的含量测定，也有白芷药材HPLC指纹图谱的研究[12,13]，但均未能较全面表征白芷药材成分及影响各批次白芷药材差异的标志性成分。

指纹图谱和化学识别模式是评价中药质量的重要方法，指纹图谱可对中药的已知和未知成分进行全面综合地表征，化学模式识别可以对指纹图谱的信息进行数字化表达、识别和处理，两者结合可以更加科学、客观、系统地反映药材的质量信息，并越来越多的用于中药材的质量评价[14,15]。本研究拟采用高效、高灵敏度的UPLC方法，建立白芷不同产地和加工方式的UPLC指纹图谱，采用对照品对各共有色谱峰进行化学指认，并结合聚类分析(cluster analysis，CA)、主成分分析(principalcomponent analysis，PCA)以及正交偏最小二乘法-判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等化学模式识别方法对所得指纹图谱进行综合分析，为白芷药材全面的质量控制提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Acquity UPLC H-Class超高效液相色谱系统，配备Acquity UPLC PDA检测器、Empower2工作站(美国Waters公司)；Legend Micro 17R微量离心机(美国Thermo公司)；CPA225D电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；FA2004B电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；VORTEX-5涡旋仪(其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 药品与试剂

花椒毒酚(批号：HX106886198)、异紫花前胡内酯(批号：HM048527198)、水合氧化前胡素(批号：HA061413198)、白当归素(批号：HB157470198)、补骨脂素(批号：HP018120198)、花椒毒素(批号：HA061509198)、佛手柑内酯(批号：HB204394198)、氧化前胡素(批号：HA062924198)、欧前胡素(批号：HI041232198)、异欧前胡素(批号：HI041233198)，以上对照品均购自宝鸡辰光生物科技有限公司，纯度>98%。甲醇(色谱纯，美国Fisher公司)、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)，其余为分析纯；水为屈臣氏纯净水。本实验搜集了四川、杭州、安徽、河南、河北等地的白芷药材样品，信息见表1，经陕西中医药大学陕西省中药资源产业化协同创新中心刘世军副教授鉴定，为白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.F.var.formosana (Boiss.)Shan et Yuan的干燥根，其中S1、S3、S4、S7批次为硫磺熏蒸过的白芷样品，S2、S5、S6、S8、S9、S10批次为无硫磺熏蒸过的白芷样品。

表1 白芷药材样品信息

续表1(Continued Tab.1)

批次Batch编号Sample药材Medicinalmaterial产地Origin加工方式ProcessingmethodS52018042205杭白芷浙江无硫熏S62018042206亳白芷安徽亳州无硫熏S72018042207亳白芷安徽亳州硫熏S82018042208禹白芷河南禹州无硫熏S92018042209祁白芷河北安国无硫熏S102018042210祁白芷河北安国无硫熏

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：水(A)-乙腈(B)；梯度洗脱(0～5 min，10%～25% B；5～18 min，25%～60% B；18～22 min，60%～90% B；22～25 min，90%～10% B；25～30 min，10% B)；流速：0.2 mL/min；检测波长：254 nm；进样量为2 μL；柱温25 ℃。在上述条件下，各色谱峰分离度良好，10批药材的指纹图谱和对照图谱见图1、图2。

图1 10批白芷药材的UPLC指纹图谱Fig.1 UPLC fingerprints of ten batches of A.dahurica 注：R 为对照指纹图谱；S1～S10 分别为1～10批白芷药材样品。Note:R-the reference fingerprint;S1～S10 were A.dahurica samples.

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，分别加甲醇溶解并稀释制备成浓度为1 mg/mL的对照品储备溶液；精密吸取上述各对照品储备溶液适量，混合后加甲醇稀释，配置混合对照品储备液，其中含欧前胡素、异欧前胡素和氧化前胡素500 μg/mL，水合氧化前胡素250 μg/mL，花椒毒酚、白当归素和佛手柑内酯50 μg/mL，异紫花前胡内酯、补骨脂素和花椒毒素25 μg/mL。

2.3 供试品溶液制备

取白芷样品粉末(过3号筛)约1 g，精密称定，置于50 mL的具塞锥形瓶，加入甲醇20 mL，称重，超声(功率300 W，频率50 kHz)提取1.5 h，取出，放冷，用甲醇补足重量，摇匀，滤过，即得供试品溶液，经0.22 μm滤膜滤过后进入UPLC分析。

3 指纹图谱研究结果与分析

3.1 方法学考察

3.1.1 精密度试验

按“2.3”项下方法制备1份供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件重复进样6次，由于欧前胡素在各批次白芷中均有出现，分离度良好且峰面积较大，故选择欧前胡素(11号峰)作为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间和峰面积RSD均在3%以内，表明仪器精密度良好。

图2 白芷药材的对照图谱Fig.2 Reference fingerprints of A.dahurica

3.1.2 稳定性试验

按“2.3”项下方法制备供试品溶液，室温下放置，按“2.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24、48 h时进样分析，以欧前胡素作为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间和峰面积RSD均在3%以内，表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

3.1.3 重复性试验

按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，“2.1”项下色谱条件进样分析，以欧前胡素作为参照峰(S)，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间和峰面积RSD均在3%以内，符合指纹图谱测定要求。

3.2 指纹图谱的建立及相似度评价

取10批白芷药材按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下检测，记录色谱图。将所有数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.1版本)”软件进行处理，标定22个共有峰，见图1。10批白芷药材指纹图谱与对照指纹图谱比对，进行相似度评价，其相似度依次为0.744、0.998、0.723、0.744、0.979、0.983、0.802、0.995、0.939、0.991，介于0.723～0.998之间。硫熏批次样品(S1、S3、S4、S7)图谱与对照图谱的相似度范围为0.723～0.802，小于 0.9；无硫熏批次样品(S2、S5、S6、S8、S9、S10)与对照图谱的相似度范围为0.939～0.998， 均大于0.9，可见无硫熏药材质量与对照图谱比较接近，质量稳定，优于硫熏样品。

3.3 主要色谱峰的化学指认

本研究采用对照品对各共有色谱峰进行化学指认，经比对保留时间和紫外光谱两项指标，最终确认了2、3、4、5、6、7、8、10、11、13等10个色谱峰，分别为花椒毒酚、异紫花前胡内酯、水合氧化前胡素、白当归素、补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素等呋喃香豆素成分(见图3)。

图3 混合对照品(A)和白芷样品(B)的UPLC色谱图Fig.3 UPLC chromatograms of mixed standard (A) and A.dahurica (B)注：2-花椒毒酚；3-异紫花前胡内酯；4-水合氧化前胡素；5-白当归素；6-补骨脂素；7-花椒毒素；8-佛手柑内酯；10-氧化前胡素；11-欧前胡素；13-异欧前胡素。Note:2-xanthotoxol;3- marmesin;4-oxypeucedaninhydrate;5-byak-angelicin;6-psoralen;7-xanthotoxin;8-bergapten;10-oxypeucedanin;11-imperatorin;13-isoimperatorin.

3.4 聚类分析(CA)

选择白芷指纹图谱中22个共有峰，将其峰面积相对于称样量量化，将10批样品UPLC图谱中22个共有峰的峰面积值标准化，组成10×22阶原始数据矩阵，运用SPSS 22.0数据统计软件，选用平均组间连接聚类，利用平均欧式距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析，结果如图4所示，横坐标为样品间的距离，纵坐标为白芷药材样品编号(与表1相同)。由图4可知，各批次白芷样品主要分为两大类，S1～S7聚为一大类(Ⅰ组)，其中S1、S3、S4、S7均为硫熏批次样品，聚为一类；S2、S5、S6分别为四川、杭州、安徽无硫熏批次样品，聚为一类；S8、S9、S10为河南、河北产地无硫熏批次样品，聚为一大类(Ⅱ组)。

图4 聚类分析结果Fig.4 Results of hierarchical cluster analysis

3.5 主成分分析(PCA)

用SPSS 22.0软件对量化的各共有峰峰面积进行标准化处理后，对10批白芷药材指纹图谱所得的22个共有峰进行主成分分析，求出相关矩阵的特征值及其方差，见表2。共提取出4个主成分，其中前3个主成分的累积方差贡献率达到81.7%，可代表白芷指纹图谱共有峰的大部分信息。

表2 主成分特征值及方差

主成分载荷矩阵反映了各变量对主成分的贡献大小和作用方向，由图5可见，22个变量对主成分1多成正相关，其中共有峰3、8～14、16、18、21对其贡献最大；共有峰15、19、20对主成分2贡献最大，共有峰4、5与其呈负相关；共有峰4、15、17对主成分3贡献最大，共有峰7与其呈负相关。

进一步通过将各特征向量中心化和标准化后，10批样品主成分得分如图6所示，并以样品的第 1、2、3主成分得分做三维散点图，见图7。如图所示，S1、S3、S4、S7硫熏批次样品聚为一类，S2、S5、S6批次样品聚为一类，这与聚类分析结果完全一致；S8、S9批次样品聚为一类，S10号无硫熏批次样品，虽与S8、S9距离稍远，但均与第1主成分成正相关。

图5 22个共有峰3个主成分的排序坐标图Fig.5 Coordinate diagram of three principal components in 22 common peaks

图6 10批白芷药材3个主成分的排序坐标图Fig.6 Coordinate diagram of three principal components in ten batches

图7 主成分得分图Fig.7 PCA score figure

3.6 正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

为进一步筛选出对不同批次白芷药材质量贡献较大的成分，本研究采用Simca 14.1软件进行OPLS-DA分析。筛选变量重要性投影值(variable importance in project,VIP)>1.0的色谱峰，即该色谱峰对整体模型的贡献度高于平均水平。结果见图8，横坐标为指纹图对应的色谱峰编号，纵坐标为各色谱峰对应的VIP值，根据VIP>1.0，共找到8个有意义变量，按照VIP值大小依次为 11号峰(欧前胡素)、8号峰(佛手柑内酯)、9号峰、12号峰、10号峰(氧化前胡素)、13号峰(异欧前胡素)、16号峰、5号峰(白当归素)。表明上述色谱峰所对应的化合物是白芷各批次药材之间产生差异的主要标志性成分，提示在白芷的质量控制和品质评价中，应重点关注这些成分的质量变化。

图8 10批次白芷药材中各活性成分的VIP值Fig.8 VIP plot of active ingredients in ten batches of A.dahurica

3.7 组间差异性分析

为进一步分析影响药材质量差异的主要成分，对22个共有峰进行有无硫熏以及不同产地的组间差异性分析，结果见表3。结果显示，22个共有峰中有8个峰的峰面积在硫熏批次样品(S1、S3、S4、S7)和无硫熏批次样品(S2、S5、S6、S8、S9、S10)间存在显著差异(P<0.05)，无硫熏样品中差异峰的峰面积显著高于硫熏样品；8个差异峰分别是5号峰、8～13号峰和16号峰，与OPLS-DA分析结果是一致的。

由于收集的相同产地批次样品较少，根据聚类分析结果以及白芷产地的地理位置，分析北方产地(河南、河北)和南方产地(四川、浙江、安徽)无硫熏批次样品间的差异性成分。组间差异性结果(表3)显示： 4号峰、8～13号峰和14号峰的峰面积在北方和南方产地中均存在显著差异(P<0.05)，除4号峰外，其他差异峰在北方产地的峰面积显著高于南方产地。

表3 组间差异性分析

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 无硫熏批次样品vs硫熏批次样品；#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 北方产地vs南方产地。

Note:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 samples without sulfur fumigationvssamples with sulfur fumigation;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 the northern originvsthe southern region.

4 结论

本研究分别对提取溶剂(50%甲醇、75%甲醇、纯甲醇、50%乙醇、75%乙醇、乙醇)、药材-溶液比(1∶10、1∶20、1∶50、1∶100)以及超声提取时间(0.5、0.75、1.0、1.5 h)进行了系统考察，以提取方法稳定可行，提取效率最优，色谱峰响应、分离度良好为指标，最终选择的提取溶剂为纯甲醇、药材-溶液比为1∶20、超声提取时间为1.5 h。

通过考察了样品在甲醇-水、乙睛-水、甲醇-酸水和乙睛-酸水作为流动相系统时，各色谱峰的分离效果，发现乙睛-水作为流动相系统时，各色谱峰的分离度最好，峰形最佳，基线较平稳。用 PDA 检测器对样品进行190～400 nm全波长扫描，比较各波长下色谱图：除异紫花前胡内酯在325 nm左右有较大吸收外，其他呋喃香豆素成分均在254 nm有较大吸收，且在254 nm处，色谱峰个数较多，分离度好，响应合理，因此选定254 nm为白芷药材指纹图谱的测定波长。

白芷是一味重要的传统中药，临床应用广泛，但对其质量控制，尚缺乏系统的研究报道。本研究选取不同产地及处理方式的白芷药材作为研究对象，建立了UPLC指纹图谱，共标定了22个共有峰，通过对照品对其中的10个成分进行化学指认。依次运用相似度分析、CA、PCA、OPLS-DA、组间差异性分析这5种方法对不同产地的白芷药材 UPLC指纹图谱进行分析，相似度分析、CA和PCA结果均说明，硫磺熏蒸是导致白芷药材质量差异的重要因素，没有硫磺熏蒸的白芷药材质量明显优于硫磺熏蒸样品。通过CA和PCA分析，硫熏批次样品聚为一类，四川、杭州、安徽无硫熏批次样品聚为一类，河南河北产地无硫熏批次样品聚为一类，说明各产地白芷药材质量存在一定差异。进一步采用OPLS-DA，筛选出影响不同批次白芷药材质量的主要成分，共找到8个主要差异性成分，经对照品化学指认出其中5个成分，分别为欧前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素、异欧前胡素和白当归素，还需进一步借助质谱等方法对其他3个重要的差异质量标志物进行鉴定分析。最后对22个共有峰进行了有无硫熏以及不同产地的组间差异性分析，有无硫熏两种不同处理方式间有显著差异的成分与OPLS-DA分析的主要成分相同，无硫熏样品优于硫熏样品，这与硫熏影响白芷的镇痛作用研究是相符的，为硫熏导致白芷的药效作用降低提供了物质基础；北方省份(河南、河北)和南方省份(四川、浙江、安徽)的白芷样品间也存在较显著差异，河南河北产地样品优于四川、浙江和安徽产地样品。8～13号共有峰是影响白芷药材质量的中药成分，虽未见不同产地白芷药材药效作用差异的研究报道，但根据我们前期的药代动力学研究结果[1,3]，8号峰(佛手柑内酯)、10号峰(氧化前胡素)、11号峰(欧前胡素)、13号峰(异欧前胡素)等均是白芷药材的主要入血成分，且这些成分也是影响白芷药效的主要成分，其含量高低直接影响临床疗效。上述实验说明，硫熏和地理位置是影响白芷药材质量的两个重要因素，可通过主要差异性成分对不同处理方式和产地的白芷药材质量进行分析。

本研究首次采用指纹图谱结合化学模式识别技术，较为系统、整体和全面的对不同批次白芷药材质量进行了深入探索，对不同产地和处理方法的白芷药材进行分类，并筛选出了影响白芷药材质量的差异质量标志物，为白芷活性成分的鉴定、分析、质量控制和物质基础研究等提供了准确、丰富的信息，补充了现有质量评价方法的不足，同时为中药全面质量评价研究提供借鉴与思路。