大剂量甲氨蝶呤血药浓度影响因素和检测方法的研究进展

赵新才，卢 进，吴红媛，徐 嵘，郭 澄，张剑萍

(上海交通大学附属第六人民医院药剂科，上海 200233)

甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)是一种抗代谢的细胞毒药物，临床广泛应用于实体瘤、急性淋巴细胞白血病和类风湿性关节炎的治疗。MTX主要通过竞争性抑制细胞中二氢叶酸还原酶的活性，阻止二氢叶酸(FH2)还原为四氢叶酸(FH4)，从而使嘌呤核苷酸和胸腺嘧啶核苷酸生物合成过程中的一碳基团的转移受阻，抑制DNA和RNA的生物合成，最终抑制肿瘤细胞的生长与繁殖[1]。大剂量甲氨蝶呤(high-dose methotrexate，HD-MTX)定义为MTX的给药剂量>1 g/m2，较大剂量的用药可以增加MTX的血药浓度，使MTX向细胞内的转运增加，不仅可以增强疗效，还可以克服耐药性[2]。HD-MTX辅以亚叶酸钙的解救疗法是临床上多种癌症的治疗方案，包括急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤、恶性淋巴瘤、乳腺癌、头颈癌等[3-4]。然而，HD-MTX给药时的毒性较大，常见的不良反应有骨髓抑制、口腔及消化道黏膜损伤、肝肾功能损伤等，严重者可危及患者生命，且其在人体内代谢的个体差异显著。因此,在临床应用中应了解影响其血药浓度的因素,在血药浓度监测指导下，及时、足量地给予亚叶酸钙解救治疗，并给予水化、碱化尿液处理，这样才能保证HD-MTX的安全使用[5]。

1 药动学

目前文献已报道的药动学模型中，HD-MTX的药动学大多符合二室模型，仅有个别实验研究符合三室模型，研究表明其二室模型优于三室模型，二室模型不但具有很好的拟合度和直观的预测检验结果，而且可以获得更理想的目标函数值[6-7]。MTX为弱酸性物质，其蛋白结合率接近50%[8]，很难通过血脑屏障，除脑组织外可广泛分布于体内各组织，并且可分布在体内第三间隙积蓄的体液中，如胸水、腹水、或滑膜液，少量MTX及其代谢产物在某些组织中可滞留较长时间，如在肾脏可滞留数周，在肝脏可滞留数月[9]。HD-MTX给药后，部分被肝醛氧化酶代谢为7-OH-MTX，少部分被代谢生成4-氨基-4-脱氧-N-10-甲基蝶酸[1]。MTX主要经肾脏排泄，6 h内大约有41%以原型通过尿液排泄，24 h内约90%通过肾脏排泄，部分可能经由胆道，最后经粪便排出[6,10]。患者肾功能损伤时，MTX的排泄会减少，在这种情况下血清和组织细胞中的药物可能会迅速增多。HD-MTX对机体的毒性与其在体内消除阶段的浓度密切相关。研究认为，在用药24、48和72 h后，MTX浓度分别超过10、1和0.1 μmol/L时，则有可能出现不可逆的严重不良反应[11]。

2 血药浓度的影响因素

2.1 药物相互作用 HD-MTX进入血液后可与血浆蛋白结合，其药物活性形式是血浆中未结合的游离部分。因此在化疗期间合用血浆蛋白结合率高的药物，例如水杨酸盐、磺胺类药物、磺酰脲类药物、保泰松和苯妥英钠等，会造成游离的MTX血药浓度升高，增加其组织效应，同时增加其毒性风险。MTX属弱酸性药物，故其他弱酸性药物，如丙磺舒，能竞争性地抑制MTX的肾小管分泌，减慢其排泄，导致中毒。非甾体类抗炎药也会取代MTX与血浆蛋白结合，并且会抑制MTX的肾脏清除，从而导致MTX血清浓度升高，因此非甾体类抗炎药不应该在HD-MTX化疗之前或同时使用[12]，已有报道在HD-MTX化疗期间合用非甾体类抗炎药可导致死亡。抗生素如青霉素和氨基糖苷类会降低MTX的肾脏清除率，导致其肾毒性增加。Dalle等[13]报道了2例患者在HD-MTX化疗期间合用环丙沙星出现MTX延迟排泄而产生严重毒性。质子泵抑制剂(PPI)可能延缓MTX的排泄，建议应避免与HD-MTX合用。Narumi等[14]对43例HD-MTX化疗的患者进行分析，结果显示合用PPI会导致MTX排泄延迟。Santucci等[15]对79例用HD-MTX化疗的患者进行回顾性分析，发现合用PPI也会导致MTX延迟排泄。另外，在骨肉瘤患者的治疗中，如果HD-MTX与有潜在肾毒性的化疗药物如顺铂联用时，需要慎重。

2.2 疾病 一些与药物的性质及其生物转化、排泄等有关的疾病都会影响血药浓度。HD-MTX给药后主要由肾脏排泄，在患者肾功能损伤的情况下使用该药会导致血药浓度累积甚至加重肾功能损伤。理论上，老年人的肝、肾功能有所减退，因此老年人用MTX化疗期间应密切监测血药浓度。MTX会在第三间隙液(如胸水、腹水、滑膜液)中积聚，延缓清除，因此当患者存在胸水、腹水或水肿等病理状态时应延后给药[9]。邹羽真等[16]研究发现患者的肌酐清除率和白蛋白(ALB)水平对MTX血药浓度分布的影响具有统计学意义，肌酐清除率下降会造成MTX清除减慢，血药浓度升高。临床应用HD-MTX的过程中发现，当患者基础ALB水平低时，容易发生MTX毒性反应，分析原因可能是ALB水平低时极易发生第三间隙水肿；另外，当ALB水平很低，特别是合并用其他血浆蛋白结合率高的药物时，游离MTX水平更高，导致毒性反应更显著，建议给药前常规检测患者的ALB水平。

2.3 个体差异 MTX在体内的代谢和消除具有显著的个体差异，近年来通过药物基因组学研究MTX代谢差异性的原因成为国内外研究的热点。研究发现，影响叶酸代谢的甲基四氢叶酸还原酶(methyltetrahydrofolate reductase，MTHFR)和还原叶酸载体(reduced folate carrier，RFC)的基因多态性与HD-MTX的药动学、毒性反应和无事件生存率(event free survival，EFS)密切相关，MTHFR677TT基因型患者与677CC型相比，MTX半衰期和药-时曲线下面积(AUC)增加，清除率下降，毒性反应较高，EFS下降；而RFC突变型患者的EFS明显优于野生型患者[17-19]。MTX主要经过肾脏排泄出体外，但是会有4%～20%的MTX 经由阴离子转运体多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein 2，MRP2) 转运、分泌至胆汁[10]，MRP2缺乏会导致胆汁流量显著降低。MRP2是由ABCC2基因编码的，该基因具有显著的基因突变现象，且ABCC2 4240C>T和4568A>C被认为是对MRP2蛋白活性影响最大的基因突变[20]。因此，在HD-MTX个体化用药时应结合患者的基因型调整给药剂量，制定个体化给药方案。

3 血药浓度检测方法

目前HD-MTX化疗后血药浓度检测方法主要有免疫学方法、高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等，免疫学方法多用荧光偏振免疫法(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)和酶增强免疫法(enzyme-multiplied immunoassay technique,EMIT)。

3.1 免疫学方法 FPIA是20世纪70年代根据荧光偏振原理建立的一种定量免疫分析方法，EMIT是一种均相酶免疫分析技术，二者均是利用免疫学原理进行特异性分析。FPIA和EMIT测定的自动化程度高，所需样本量较少，操作较简便，但专属性不强。由于HD-MTX给药后的代谢产物4-氨基-4-脱氧-N-10-甲基蝶酸和7-OH-MTX与MTX结构相似，所以MTX浓度测定结果会不同程度地受到这两种代谢产物的交叉反应的影响，导致MTX血药浓度测定存在偏差。而且与仪器配套的免疫试剂盒价格昂贵，线性范围较窄，有效期短，如果遇到浓度高的样品需要稀释并重复检测，增加成本和检测时间[21]。目前雅培公司研制的FPIA试剂盒已经停产，因此FPIA在临床推广受到限制。

3.2 HPLC法 HPLC法是一种色谱分析法，采用合适的固定相和流动相可将药物和体内代谢物进行良好的分离，具有专一性强、灵敏度高、适用性强等优点。HPLC法是目前检测HD-MTX血药浓度最常用的方法[22]。该方法可以将MTX原型及其代谢产物分离后，准确测定MTX的浓度，不受代谢产物的影响，特异性强、灵敏度高、测定浓度范围较宽。但是HPLC法血浆前处理过程较繁琐，测定时间和出检测报告时间较免疫分析法长，样本用量较免疫分析法大，并且HPLC法的方法学种类多样，要求操作人员必须掌握熟练的分析技术。

3.3 LC-MS法 LC-MS法是20世纪90年代发展起来的以液相色谱作为分离系统、质谱为检测系统的综合分析技术。目前，国外应用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)对MTX及其代谢产物进行浓度测定的灵敏度和特异度均处于较高水平[23-24]，由于LC-MS/MS法费用较高，国内医院采用该方法测定MTX血药浓度的报道还较少[25-27]。LC-MS/MS法测定MTX的血药浓度，通常前处理只需进行简单的蛋白质沉淀，且因特异性强、专属性好、灵敏度高、分析时间短等特点，检测HD-MTX给药后的血药浓度较为适用，同时可作为HPLC法和免疫学方法的一个重要补充。

需要注意的是，在临床应用HPLC或LC-MS/MS法测定HD-MTX给药后血药浓度时，会有来自其他药物的干扰。研究发现，头孢曲松钠与MTX出峰重叠，会干扰MTX浓度测定，易造成MTX检测结果偏高，因此在用HD-MTX化疗时应尽可能避免同时使用头孢曲松钠[28]。另外，由阿糖胞苷转化而来的阿糖尿苷与MTX结构相似，二者保留时间也很接近，联合用药浓度检测时应注意有效的色谱分离[29]。

4 结 语

HD-MTX在急性淋巴细胞白血病、骨肉瘤等恶性肿瘤中的应用提高了患者的生存率和存活时间，但由于药物相互作用及个体差异等多种影响因素，HD-MTX给药后排泄延迟现象仍然存在。目前，国内主要采用的HD-MTX化疗监测时间点和浓度标准为：每一疗程以MTX滴注完毕为零时，在24、48和72 h分别采血，检测MTX血药浓度。若MTX 24 h的血药浓度>10 μmol/L，48 h的血药浓度>1.0 μmol/L，72 h的血药浓度>0.1 μmol/L，则预示代谢延迟，此时应增加亚叶酸钙解救(增加给药次数或剂量)，加强水化、碱化尿液治疗和预防性保护肝脏、心脏功能，并继续监测MTX浓度，直至血药浓度<0.1 μmol/L。随着精准医疗和基因组学的发展，临床用MTX化疗时可联合基因检测结果为患者选择适宜的初始给药剂量，并根据血药浓度监测结果及时调整给药方案，从而降低药品不良反应发生率，使患者得到更加安全、有效的药物治疗。