绵白糖中还原糖分含量测定方法的对比研究

赵亚红，杨 丽，刘东旭，刘 琳，迟雅丽，王 健,2，陈花山*，赵抒娜

(1中粮糖业辽宁有限公司，辽宁营口115212；2中粮营养健康研究院有限公司，老年营养食品研究北京市工程实验室，营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京昌平102209；3中粮屯河糖业股份有限公司，农业部糖料与番茄质量安全控制重点实验室，新疆昌吉831100)

0 前言

绵白糖简称绵糖，是人们喜爱的调味增味甜味剂，其晶粒细小、细腻、质地绵软，适合直接食用，同时也可以为食品上色，在做面制品时也更易溶于面团中[1-2]。由于绵白糖在生产过程中喷入了 2.5%左右的转化糖浆，所以其还原糖分高于普通白砂糖的还原糖分。对于绵白糖中的还原糖分，如果含量过高会导致绵白糖吸潮滋生微生物，不利于绵白糖的保存，而含量过低则会影响绵白糖的风味，因此还原糖分被列为绵白糖质量控制国家标准规定的必检指标。GB/T 1445-2018《绵白糖》[3]规定绵白糖中还原糖分标准在1.5%～2.5%之间，在检测方法上，大部分企业都是依据QB/T 5012-2016《绵白糖试验方法》[4]中的兰-艾农恒容法检测绵白糖还原糖分。该方法用样液滴定一定量的斐林氏试剂，滴定前加入预测的水分以保持最终容量恒定，根据耗用样液的量，查表得校正系数，计算还原糖分的含量。该方法操作复杂，计算较繁琐，严重限制其在绵白糖生产企业对多个批次产品检测时的应用，所以需要开发出一种操作简便、节省时间、准确度高、重复性好的检测方法来检测绵白糖中的还原糖分。

目前，国内外学者围绕食品中还原糖分检测开发了一系列的方法。张弛等[5]综述比较了食品中还原糖测定方法，分析比较了各种方法检验的优缺点。张学英等[6]通过斐林试剂滴定法和 3,5-二硝基水杨酸比色法测定菊芋中还原糖分含量，对于较高浓度样品的检测，平行样检测 RSD分别为 2.00%和1.68%；但对于浓度较低(比色液糖含量低于1500 μg以下)样品，滴定法检测样品平行性较差，精密度一般在 8%～13%，而比色法精密度一般在 2.0%～4.5%。田翔等[7]建立了 3,5-二硝基水杨酸比色法，通过与GB/T 5513-2008《粮油检验 粮食中还原糖和非还原糖测定》[8]中铁氰化钾法比较分析，3,5-二硝基水杨酸比色法可代替国标方法测定糜子还原糖。马蓉等[9]和袁梦等[10]采用高效液相色谱(HPLC)-示差折光测定蜂蜜中还原糖的含量；梁智安等[11]利用HPLC-示差折光测定酒中的总糖和还原糖。HPLC-示差折光法对样品没有特殊要求，按一定浓度配制溶液即可测定，可以快速检测样品中的糖类物质，具有不破坏样品、重现性好、分辨率高等优点[12]，在测定糖类物质方面具有独特优势，操作简单，结果准确可靠[13-15]。

目前，测定绵白糖还原糖的方法只有国家标准要求的斐林试剂滴定法，研究HPLC-示差折光法测定绵白糖还原糖分鲜有报道。由于绵白糖与蜂蜜、酒的体系存在较大差异，需针对绵白糖特定体系开发还原糖分含量的检测方法。本文的目的在于以斐林试剂滴定法检测的数据为理论值，采用HPLC-示差折光法测定绵白糖还原糖分，通过分析2种方法的相关性，并提供可靠的数据来支撑HPLC-示差折光法的准确性论证，推动HPLC-示差折光法在快速检测绵白糖还原糖分的应用。

1 试剂与仪器

1.1 主要试剂

绵白糖，中粮糖业辽宁有限公司；乙腈(色谱纯)，成都市科隆化学品有限公司；磷酸氢二钠(分析纯)，成都市科隆化学品有限公司；磷酸二氢钠(分析纯)，天津市大茂化学试剂厂；葡萄糖(标准品)，中国食品药品检定研究院；果糖(标准品)，中国食品药品检定研究院。

1.2 主要仪器

液相色谱仪、示差折光检测器，大连依利特分析仪器有限公司；超纯水器，Master系列；0.45 μm水相滤膜，天津津腾实验设备有限公司；真空干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 干燥失重含量的测定

依据QB/T 5012-2016《绵白糖试验方法》[4]进行检测，将样品在一定温度及真空度的条件下进行干燥后称量，根据干燥前后样品失去的质量计算出样品的干燥失重，每个样品重复测定3次。

2.2 标准溶液的配制

果糖标准溶液配制：准确称取果糖标准品0.0500 g，精确至0.0001 g，用超纯水溶解并定容至5 mL，摇匀，即得浓度为10 g/L的果糖标准溶液。

葡萄糖标准溶液配制：准确称取葡萄糖标准品0.0500 g，精确至0.0001 g，用超纯水溶解并定容至5 mL，摇匀，即得浓度为10 g/L的葡萄糖标准溶液。

2.3 标准曲线的制备

分别称取果糖和葡萄糖标准品0.500 g，溶解并定容至50 mL，配制成含量为10 g/L的混合标准贮备溶液。分别吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL上述混合标准品贮备液于10 mL的容量瓶中，用超纯水定容，制备分别相当于0.5、1、2、3、4 g/L的标准品溶液，溶液过 0.45 μm水相滤膜备用。分别以 2种糖的浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，进行线性回归分析。回归方程见表1，2种糖线性相关系数r均大于0.998。

色谱条件：依利特Hypersil-NH2-S色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：乙腈+磷酸盐缓冲液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，柱温：30℃；进样体积：20 μL；依利特RID检测器，检测池温度：40℃。

表1 果糖和葡萄糖的标准曲线方程

2.4 绵白糖测定

称取绵白糖样品20.00 g，精确至0.01 g，用超纯水溶解，并定容至400 mL，摇匀。稀释3倍后，经0.45 μm水相滤膜过滤后，根据以上设定的色谱条件进行上机测定，每个样品重复测定3次。

2.5 斐林试剂法

根据QB/T 5012-2016《绵白糖试验方法》[4]的方法配制溶液，采用斐林试剂法滴定还原糖，每个样品平行测定3次。

2.6 统计分析

数据用平均值±标准差表示，所得数据使用SPSS 25.0软件进行多个样本均数之间两两比较的成对样本t检验，配对样本相关性P＜0.05时具有样本相关性显著。

3 结果与讨论

3.1 谱图分析

流动相：乙腈+磷酸盐缓冲液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，分别将绵白糖样品、葡萄糖标准溶液和果糖标准溶液进样，其峰型分别如图1、图2、图3所示，出峰时间见表2。

图1 绵白糖样品(浓度为13.33 g/L)

图2 果糖标准品

图3 葡萄糖标准品

由图1和表2可知，绵白糖样品共有3个峰，将样品中的第1个峰和第2个峰的出峰时间与图2和图3的果糖和葡萄糖标准品进行对照，可以发现果糖、葡萄糖出峰时间相近，表明图1第1个峰为果糖峰，第2个峰为葡萄糖峰，则第3个峰为蔗糖峰。由图1可知绵白糖组成成分较单一，由果糖、葡萄糖和蔗糖组成，一般蔗糖分不具有还原性，还原糖分的含量实则为果糖和葡萄糖含量的总和。在计算还原糖分含量时，蔗糖分含量也可以一同计算。此外，按照流动相条件：乙腈+磷酸盐缓冲液=73%+27%(V︰V)，pH=5；流速：1.0 mL/min，可使检测时成分出峰时间较短，并具有较高分离度，能够满足化验室快速检测的要求。

3.2 检测结果

表2 样品与标准品的出峰时间

选取还原糖分含量不同的绵白糖样品，按照QB/T 5012-2016《绵白糖试验方法》检测干燥失重含量，同时采用HPLC-示差折光法和斐林试剂滴定法2种方法检测还原糖分含量，结果如表3所示。由于绵白糖的电导灰分远低于蔗糖、还原糖分和水分，在计算总糖分时忽略电导灰分的影响，而蔗糖分和还原糖分的含量则根据标准曲线计算所得的质量浓度进行计算，计算公式如下所示：

总糖分(%)=100-水分含量·······················(1)

式中：C果糖为绵白糖样品根据果糖的标准曲线计算得到的浓度(g/L)；C葡萄糖为绵白糖样品根据葡萄糖的标准曲线计算得到的浓度(g/L)；C样品为绵白糖样品进样分析的浓度(g/L)。

3.3 方法对比分析

表3 还原糖分检测结果对比

通过图1的谱图分析可以看出绵白糖由3种糖组成，分别为果糖、葡萄糖和蔗糖，经过计算分析可知，果糖、葡萄糖含量之和与斐林试剂法检测的还原糖分含量接近，通过SPSS软件来研究HPLC-示差折光法与斐林试剂法的相关性。根据SPSS 25.0软件分析的结果可知：2种检测方法下的平均值分别为2.0138 g/100g和2.0577 g/100g，标准差分别为0.32351和0.34245，说明HPLC-示差折光法的均值较低，标准差较小。经计算2种检测方法相关系数为0.983(P＜0.05)，由此得出2种方法的检测结果相关性显著。由表2可知，由水分含量可计算还原糖含量，HPLC-示差折光法RSD值为0.06%～0.9%，斐林试剂滴定法RSD值为0.11%～3.1%，由此得出HPLC-示差折光法要明显低于斐林试剂法的实验相对标准偏差，表明数据的精密度较好。

斐林试剂滴定法用样液滴定一定量的斐林氏试剂，滴定前加入预测的水分以保持最终容量恒定，根据耗用样液的量，查表得校正系数，计算还原糖分的含量。该方法操作复杂，计算较繁琐，而且检测结果易受试剂溶液颜色的影响，客观因素对其影响因素较大，终点不易判定。示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液折光率的变化而对样品浓度进行测定的，通过标准品对所分离的组分进行标定，就可以准确快速地得到还原糖的质量。和斐林试剂法相比，所得结果偏差值较小，且操作简单、快速，客观因素对其影响较小。

4 结论

本文采用HPLC-示差折光检测法和斐林试剂滴定法检测绵白糖中还原糖分的含量，旨在对比采用HPLC-示差折光法与斐林试剂法对绵白糖还原糖分含量进行检测的方法差异，初步探讨研究了采用HPLC-示差折光法检测绵白糖还原糖分含量的可行性。与斐林试剂滴定法相比，利用HPLC-示差折光法测定绵白糖中的还原糖，方法简单，操作快捷方便，能有效地测定出其还原糖含量，测定其结果准确可靠。本研究为HPLC-示差折光法的准确性提供可靠的数据支撑，有助于推动HPLC-示差折光法在快速检测绵白糖还原糖分的应用，提高制糖企业日常检验分析的效率。