2个甘蔗品种的遗传基础与核型分析

文明富，潘方胤，齐永文，吴嘉云，敖俊华，官锦燕，彭立冲，梁启如，罗青文

(广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所) 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州，510316)

0 引言

甘蔗(Saccharumspp.)属于单子叶植物纲(Monocotyledoneae)、禾本目(Graminales)、禾本科(Gramineae)甘蔗亚族中10属之一[1]。分子细胞遗传学研究表明，甘蔗是由多倍体原种热带种(Saccharum officinarum)作母本，多倍体野生种割手密种(Saccharum spontaneum)作父本经过一系列杂交形成的异源多倍体植物，其染色体有2n+n、n+n、n+2n、2n+2n等多种类型，且 n常常不是单倍体的原来数目，常有增减，即存在“不平衡”现象[2-4]。由于甘蔗染色体较小，数目多，种间差异大，染色体制片难度大，使得甘蔗核型分析较难，相关研究进展较慢。

一直以来，甘蔗的遗传背景及遗传方式都是育种工作者所关注的问题。Barbados报道[5]自1858年发现甘蔗可以结实，并在种内进行杂交育种开始，甘蔗育种发展史大概分为 5个阶段[6]：(1)利用热带种选育时期；(2)利用“高贵化”过程选育高贵化品种时期；(3)利用高贵化品种培育杂交后代时期；(4)利用高贵化杂交后代选育现代品种时期；(5)拓宽品种遗传组成源选育种时期。回顾150多年的甘蔗育种史，突破性甘蔗新品种的育成，实则是一个不断扩宽甘蔗遗传组成源来选育新品种的过程[7]。当前生产栽培种大多含有甘蔗属的热带种(Saccharum officinarum)、割手密种(Saccharum spontaneum)、印度种(Saccharum barberi)或中国种(Saccharum sinense)等 3种或以上的血缘[8-9]。随着甘蔗现代育种技术的不断进步，亲本或原始育种材料的遗传基础已成为有效提高育种效率的关键。因此，分析选育甘蔗品种的遗传组成、染色体组成系统演化和血缘构成的基本特征，在甘蔗育种上对正确选择骨干亲本或原始育种材料、提高育种效率具有重要意义。本研究以粤糖 06-233和粤糖 10-396为供试材料，通过遗传基础和染色体组型分析，探讨和比较它们的细胞质源、遗传组成源、染色体组成及类型分析，为今后甘蔗品种遗传改良提供遗传学和细胞学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试品种为广东省生物工程研究所(广州甘蔗糖业研究所)选育的粤糖 06-233和粤糖 10-396，其系谱图见图1。粤糖06-233于2016年5月通过全国农业技术推广服务中心鉴定，该品种早熟、糖分高、高产稳产、农艺性状好；粤糖10-396为选育的新品系，具有特早熟、宿根性强、糖分高等特性。

1.2 细胞资源和遗传组成源分析

图1 粤糖06-233和粤糖10-396系谱图

供试甘蔗品种细胞质源分析以品种的母本追溯分析，直至查出原始母本，即细胞质源[10]。遗传组成源的分析则以品种的父母本同时追溯分析，直至查出所含的全部基础种质，即遗传组成源，然后进行综合确定。

1.3 染色体标本制备

选取成熟、健壮的粤糖 06-233和粤糖 10-396蔗茎切成双芽茎段栽种于盛有河沙塑料桶中，浇水后放置于温室中培养，待其长出干净的根尖后，白天进行取样。选取颜色嫩黄、分裂旺盛的根尖，在距根尖顶端0.5～0.8 cm处用镊子掐断，置于0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理4 h，饱和对二甲苯处理2 h，转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸=3∶1)固定 24 h，70%乙醇4℃冰箱保存备用。

染色体标本制备采用酶解去壁低渗法进行处理[11-12]，即把处理的材料用蒸馏水清洗并浸泡于蒸馏水中30～60 min；再转移到5%纤维素酶和4%果胶酶混合液中，放置于37℃恒温酶解2～5 h；去除酶液，加入蒸馏水清洗并静置于蒸馏水中低渗30～60 min；去除蒸馏水，滴加临时配制的固定液(无水乙醇∶冰乙酸=3∶1)后固定15 min；在载玻片上先滴3滴固定液，夹取少量茎尖组织，并迅速涂抹在载玻片上，并在火焰上迅速烘烤置；用吉姆萨染色15 min，冲洗玻片干燥后镜检。

1.4 核型分析

用意大利Optika正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照。每份材料选择20个分散且形态较好的细胞进行染色体计数，选取5个染色体形态清晰且无重叠的中期细胞进行核型分析。之后测量其长度，根据染色体的形态特征以及对测量得到的数据进行分析，进行同源配对，排成核型图。核型分析方法根据李懋学等[13]的标准，染色体形态依据Levan等[14]的方法归类，核型对称性按 Stebbins[15]的标准划分。

臂比(r)=长臂(S)/短臂(L)·························(1)

染色体相对长度(%)=染色体长度/染色体组总度×100%·················································(2)

染色体相对长度指数(I.R.L)=染色体长度/全组染色体·····················································(3)

I.R.L＜0.76为短染色体(S)，0.76≤I.R.L≤1.00为中短染色体(M1)；1.01≤I.R.L≤1.25为中长染色体(M2)；I.R.L≥1.26为长染色体(L)。

平均长度核型不对称系数(As.K.C，%)=长臂总长/全组染色体总长×100%···························(4)

2 结果与分析

2.1 细胞质源和遗传组成源分析

通过追溯分析，2个甘蔗品种的细胞质源均为热带种班扎马新黑潭(Bandjarmasin Hitam)(表1)，这跟我国早期引种有关，当初引进的大多数种质资源都为POJ2878或其姐妹系POJ2725的后代，POJ2878曾是世界上甘蔗杂交育种的最主要亲本之一[16]，其细胞质来源于班扎马新黑潭，而国内外选育的绝大部分品种都是POJ2878后代，表明班扎马新黑潭可能是一个优秀的细胞质供体。

表1 粤糖06-233和粤糖10-396的细胞质源和基础种质

2个甘蔗品种的遗传组成是多源的，均含有割手密种、印度种、热带种和中国种的血缘(表1)。其中粤糖06-233的遗传组成源数为16个，含量最多的是热带种，主要有班扎马新黑潭(Bandjarmasin Hitam)、黑车里本(Black Cheribon)、卡路打不挺(K.Boothan)、路打士(Loethers)、拉海那(Lahaina)、斐济(Fiji)、克里斯他林那(Crystalina)、灰毛里求斯(A.mauritius)、拔地拉(Badila)；其次是中国种，包括中国种(O. Tekcha)、中国种(品种名不详)和夏威夷育巴(H. uba)；再次是割手密种，包含爪哇割手密(Glagah)和印度割手密(Co. spont)；含量最少的是高粱(Sorghum bicolor(L.) Moench)血缘。而粤糖10-396的遗传组成源数为15个，由10个热带种、1个印度种、2个割手密种及2个中国种组成。一般来讲，甘蔗品种的遗传组成源越多，其性状表现越优秀[16]。另外，研究表明，甘蔗品种的高糖源主要来自热带种[17]，亲本所含热带种质数量越多，选育出的新品种糖分高的几率越大。粤糖 10-396和粤糖 06-233的热带种血缘分别为 10个和 9个，糖分检测粤糖10-396比粤糖06-233高出近1个百分点。

2.2 核型分析

通过制片观察研究，获得了粤糖06-233和粤糖10-396的染色体数目，并对其进行了核型分析。染色体参数和核型特征见表 2，中期染色体、核型图及核型模式见图2～图5。

2.2.1 核型组成分析

表2 粤糖06-233和粤糖10-396核型分析参数

一般来讲，甘蔗不仅染色体数目多，就是同一品种在不同组织或不同生育期，观察到的染色体数目也不尽相同[18]。2个供试材料染色体在数目上差异较大，在核型和染色体相对长度组成上也存在较大的差异。粤糖 06-233的核型公式 K(2n)=88=82m+6sm，其中第3、9及第32对染色体为近中部着丝点染色体(sm)，其余为中部着丝点染色体(m)，具中部着丝粒染色体的百分比 93.18%。而粤糖10-396的核型公式K(2n)=106=2M+98m+6sm，其中第51对染色体为正中部着丝点染色体(M)，第39、40和42对染色体为近中部着丝点染色体(sm)，其余为中部着丝点染色体(m)，具中部着丝粒染色体的百分比94.34%。

2.2.2 染色体长短分析

由表2可知，粤糖06-233的染色体相对长度组成为14L+22M2+28M1+24S，粤糖10-396的染色体相对长度组成为18L+22M2+52M1+14S，2个品种染色体相对长度组成都含有长染色体(L)、中长染色体(M2)、中短染色体(M1)和短染色体(S)，相对长度组成差异不大，中长染色体(M2)和中短染色体(M1)占绝大部分，属于较原始的核型类型；粤糖06-233的染色体相对长度大于粤糖 10-396相对长度；粤糖06-233和粤糖10-396这2个品种臂长大于2的染色体比例分别为4.54%和1.89%，最长与最短染色体的比值分别为4.33和4.3。

2.2.3 核型不对称系数和核型类型分析

由表2可以看出，粤糖06-233的核型不对称系数为56.31%，核型类型属于2C型，而粤糖10-396的核型不对称系数为57.77%，核型类型属于1B型。一般来讲，核型不对称系数越小就越进化[19]，核型类型2C型的品种比1B型的品种更进化，因此粤糖06-233的进化程度高于粤糖10-396。

3 讨论

图2 粤糖06-233染色体中期分裂相和核型图

图3 粤糖10-396染色体中期分裂相和核型图

图4 粤糖06-233染色体核型模式图

图5 粤糖10-396染色体核型模式图

从甘蔗育种发展历程看，突破性甘蔗新品种的育成，需要通过不断扩宽甘蔗遗传组成源来实现[7]。当前生产栽培种大多含有甘蔗属的热带种(Saccharumofficinarum)、割手密种(Saccharum spontaneum)、印度种(Saccharumbarberi)或中国种(Saccharum sinense)等3种以上的血缘，造成了遗传基础狭窄，甘蔗亲本基因库不够丰富，长期以血缘相近的材料为亲本进行杂交，造成后代异质性低，很难选育出有突破性的甘蔗新品种[8-9,20]。本实验中粤糖 06-233和粤糖 10-396的遗传组成源数量分别为16个和15个，主要含有热带种、割手密种、印度种和中国种血缘，遗传基础相对较窄。因此，需要不断寻找可利用的新的种质资源，通过近远缘杂交向甘蔗导入新种质，以拓宽现代甘蔗的遗传基础。蔗茅属的斑茅(Saccharum arundinaceum Retz)[21]、蔗茅(Erianthus rufipilus (Steud.) Griseb)[22-23]、滇蔗茅(Erianthus rockii Keng)[24]为甘蔗的近缘属植物，具有很多优异性状，受到国内外的育种家重视。另外，河八王属的河八王(Narenga porphyrocoma (Hance)Bor)是甘蔗近缘属植物，具有耐旱、耐贫瘠、分蘖力强等优良性状[25]。通过创新利用这些甘蔗近缘属种质资源，拓宽甘蔗遗传基础，可培育更多突破性的甘蔗新品种。

植物染色体是遗传信息的载体，控制遗传变异，支配生长发育。核型分析主要通过研究其染色体数目及染色体形态特征来反映不同物种或品种之间存在的细胞学差异，不但能研究种间的遗传变异、系统演化以及亲缘关系，还可以为杂交育种选育以及杂种后代鉴定等提供理论依据。通过对粤糖06-233和粤糖10-396的核型分析结果可以看出，其染色体在数目上差异较大(分别是88条和106条)，具中部着丝粒染色体的比例分别为93.18%和94.34%，洪德元[26]认为着丝粒位于中部的染色体是最对称的同时也是最原始的。植物染色体进化方向是由对称向不对称发展，具有中部着丝点的染色体的百分比越小和核型不对称系数越大，则植物的染色体核型越不对称，也越进化，因此，粤糖06-233进化程度高于粤糖 10-396。另外，Stebbins[19]将植物染色体核型按对称性程度的高低分为12种类型(1A、2A、3A、4A；1B、2B、3B、4B；1C、2C、3C、4C)，认为核型对称性程度越高的生物，其染色体变异越小，进化程度也越低；而非对称性程度越高的生物，其染色体变异越大，进化程度越高。粤糖06-233和粤糖10-396这2个品种核型分类属于2C型和1B型，表明粤糖06-233进化程度高于粤糖10-396。