基于数据库分析RASAL1和RASAL2在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

宋姗姗，陈 昊，张 强，王永芳，聂艳红*

(1.徐州医科大学附属连云港市第一人民医院，江苏 连云港 222061； 2.连云港市第二人民医院，江苏 连云港 222023)

肺癌的发病率和死亡率位于全球恶性肿瘤的第一位，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) 占肺癌的85%，且多数患者在确诊时已处于晚期[1]。靶向治疗是NSCLC晚期患者的重要治疗手段，虽然目前的分子靶向治疗已使部分患者受益，但总体预后仍然较差，故寻找有效的分子靶标仍具有重要的临床意义。Ras蛋白激活类似物1(ras protein activator like 1，RASAL1)和大鼠肉瘤蛋白活化因子2(ras protein activator like 2，RASAL2)均属于RasGTP酶活化蛋白家族(GTPase-activating protein, RasGAP)中的GAP1家族的成员。RASAL1定位于人第12号染色体(12q24.13), 而RASAL2基因定位于人第1号染色体(1q25)，编码的蛋白由1139个氨基酸组成。两者均具有GTP酶的活性，能水解GTP为GDP使Ras蛋白失活，从而参与肿瘤的发生发展及转移[2-3]。国内外已有RASAL1和RASAL2在多种肿瘤中的研究报道[3-7]，但RASAL1和RASAL2在肺癌中的研究还较少。本文基于全球最大的癌基因芯片数据库Oncomine和生存相关的Kaplan-Meier Plotter数据库的大数据信息，综合分析RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表达及与生存预后的关系，为后期实验及潜在的临床价值提供指导。

1 材料和方法

1.1 数据库来源和方法

利用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/)分析RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表达差异。登录Oncomine数据库首页，设定条件：1)Gene:RASAL1/2; 2)Analysis Type: Cancer vs Normal Analysis。进一步分析RASAL1/2在NSCLC中的表达：① Cancer Type: Non-Small cell Lung carcinoma; ②Data Type: mRNA; ③临界值设定条件:Pvalue<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%; ④其他为数据库默认设定。最后勾选NSCLC相关研究进行compare的二次分析。

基于Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/)分析RASAL1和RASAL2与NSCLC患者临床生存预后的关系。登录Kaplan-Meier Plotter数据库首页，选择肺癌页面(Lung cancer)，设定条件: ①Gene:RASAL1/2; ②Split patients by: Auto select best cutoff; ③Survival: OS/PPS; ④Histology: adenocarcinoma/squamous cell carcinoma; ⑤勾选需要分析的分层指标；⑥其他为数据库默认设定。

1.2 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，检验均采用双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。RASAL1和RASAL2在正常组织与NSCLC组织中的表达差异采用t检验。Kaplan-Meier模型分析RASAL1和RASAL2与NSCLC患者临床生存预后之间的关系。

2 结果

2.1 RASAL1和RASAL2在NSCLC与正常组织中的表达差异

Oncomine 数据库包含715个基因表达数据集和86733个样本数据，其中RASAL1基因有549个数据集，样本数据为72466个，RASAL2基因有641个数据集，样本数据为78639个。Oncomine数据库中，RASAL1基因有355项不同类型的研究结果，其中16项差异有统计学意义，4项表达增高，12项表达降低，RASAL1在肺癌中高表达；RASAL2基因有426项不同类型的研究结果，其中23项差异有统计学意义，表达增高的研究有13项，降低的有10项，RASAL2在肺癌中低表达。综合分析11项(见附件参考文献8-15)关于RASAL1在NSCLC组织与正常组织中表达的研究，发现RASAL1在NSCLC所有差异表达基因中的中位数排名是1614.0，P=2.38E-7，表明RASAL1在NSCLC中高表达(见图1)。对RASAL2在NSCLC组织与正常组织中表达的17项研究[8，11，14-15]分析发现，在NSCLC所有差异表达基因中RASAL2的中位数排名是1486.0，P=0.013，表明RASAL2在NSCLC中低表达(见图1)。另外，分析不同病理类型NSCLC组织中RASAL1和RASAL2的表达水平发现，RASAL1在NSCLC中均高表达，RASAL2均低表达(P<0.05，见表1，表2)。

注：A RASAL1在11项NSCLC过表达研究中的比较分析；B RASAL2在17项NSCLC低表达研究中的比较分析。颜色越深表示芯片中基因表达越高。图1 RASAL1和RASAL2在Oncomine数据库中NSCLC中的表达Note. A Comparison of RASAL1 across 11 analyses over-expression; B Comparison of RASAL2 across 17 analyses under-expression. The darker the color, the higher the gene expression in the chip.Figure 1 Expression of RASAL1 and RASAL2 in NSCLC in the Oncomine database.

病理类型Pathological types 相关研究References样本量Sample size 差异倍数Difference multiplet值t valueP值P valueOkayama等[8]2464.27010.044<0.01Selamat等[9]1161.54910.836<0.01肺腺癌Lung adenocarcinomaSu等[10]661.7743.307<0.01Hou等[11]1561.5906.194<0.01Landi等[12]1071.2335.504<0.01大细胞肺癌Ding等[13]751.9853.726<0.01Large cell lung cancerHou等[11]1561.6423.797<0.01鳞状细胞癌Hou等[11]1561.1331.824<0.01Squamous cell carcinomaHou等[11]1561.4716.454<0.01

表2 不同病理类型的NSCLC组织与正常组织中RASAL2的表达差异

2.2 RASAL1和RASAL2与NSCLC患者临床预后的关系

Kaplan-Meier Plotter数据库中RASAL1在NSCLC中的研究样本为1926个，RASAL2的样本为1145个，结果显示RASAL1低表达组及RASAL2高表达组的NSCLC患者的生存预后较好。RASAL1低表达组和RASAL2高表达组患者的总生存时间(overall survival, OS)和复发后生存(post-progression survival, PPS)均显著增高(P<0.05，RASAL1的HR分别为1.35、1.39，95% CI分别为1.19～1.54、1.05～1.83，RASAL2的HR分别为0.6、0.56，95% CI分别为0.49～0.72、0.35～0.88)。进一步亚型分析，低表达RASAL1的肺鳞状细胞癌和肺腺癌患者及高表达RASAL2的肺腺癌患者的生存时间均显著长于高表达组(HR分别为1.35、1.73、0.52，95% CI分别为1.03～1.78、1.34～2.23、0.4～0.67)，而RASAL2的表达与肺鳞状细胞癌患者的生存预后无相关性。(图2)。低表达的RASAL1与接受放化疗的NSCLC患者的良好生存预后相关(样本量分别为73、178，HR分别为2.12、1.59，95%CI为1.23～3.68、1.05～2.40)，与未接受放化疗的患者的生存预后无关。而在RASAL2与NSCLC患者预后关系的研究中，接受放化疗的研究的样本例数较少，无法统计。此外，低表达的RASAL1和高表达的RASAL2与早期患者(I期和II期)的良好预后相关，在男、女及吸烟、不吸烟的患者中均与预后相关。而与分级和晚期(III期和IV期)患者的生存预后差异无统计学意义。

注：A～C： RASAL1在NSCLC、肺鳞状细胞癌、肺腺癌中；D～F： RASAL2在NSCLC、肺鳞状细胞癌、肺腺癌中。图2 RASAL1和RASAL2与NSCLC患者预后的关系Note. A-C: RASAL1 in NSCLC, lung squamous cell carcinoma, lung adenocarcinoma. D-F: RASAL2 in NSCLC, squamous cell carcinoma, and lung adenocarcinoma.Figure 2 Relationship between RASAL1 and RASAL2 expressions and prognosis in patients with NSCLC

3 讨论

NSCLC是肺癌最常见的病理类型，包括腺癌、大细胞癌和鳞状细胞癌，但确诊时多已错失手术治疗时间，故预后相对较差[16-17]。近年来，随着生物标志物的不断发现，靶向药物的临床应用，患者的生存预后有所改善[18-19]。但肺癌的高发病率及死亡率仍持续增长，故亟需寻找新的生物标志物以提高诊断、治疗及预后评估[20]。

Ras是最早发现的人类癌基因，其失调与肿瘤的发生发展密切相关。RASAL1和RASAL2作为Ras的调节基因，也与肿瘤的形成密切相关[21-22]。在胃癌中，Chen等[3]发现低表达的RASAL1能促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，显示了RASAL1的抑癌作用。Liu等[23]研究发现，上调甲状腺癌中的RASAL1同样能抑制癌细胞的生长、迁移和侵袭。此外，在肝癌[6]、结直肠癌[24]等多种肿瘤中的研究均显示RASAL1表达降低，从而促使肿瘤的发生，且低表达的RASAL1与不良预后相关。但尚未见RASAL1与NSCLC的相关报道。RASAL2在肿瘤中的研究尚存争议，Hui等[5]发现，RASAL2在膀胱癌中抑制肿瘤的发生，但在肝癌中，RASAL2上调促进肿瘤细胞的增殖和转移[25]。即使在同一种肿瘤或同一种肿瘤的不同分型中，RASAL2的研究结果也不同。在结直肠癌中，Jia等[4]研究表明，下调RASAL2能促进结直肠癌细胞的增殖，上皮-间质转化和转移，而Pan等[26]发现，RASAL2在结直肠的原发肿瘤及转移癌中表达增加，且高表达的RASAL2与患者的不良预后相关。在乳腺癌中，伴随RASAL2的失活，LuminalB型乳腺癌发生侵袭和转移[27]，但过表达的RASAL2对三阴性乳腺癌起促侵袭和转移的作用[28]。目前，关于RASAL2在肺癌中的研究，仅报道了其对肺腺癌的抑制作用[29]。鉴于此，我们通过生物数据库分析RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表达差异及与患者临床生存预后的关系，为进一步研究RASAL1和RASAL2在NSCLC中的作用提供参考和理论依据。

利用Oncomine数据库检索RASAL1基因发现：共12项研究，包括脑、食管和头颈部等多部位的肿瘤，显示RASAL1低表达；共4项研究，包括结直肠癌、卵巢癌及肺癌组织，显示RASAL1高表达。RASAL1在NSCLC组织中的研究共11项，对其二次分析发现，RASAL1在NSCLC中的表达较正常组织增加。RASAL1在肺癌中的表达与已报道的在其他肿瘤中的表达结果相反，可能是由于组织特异性导致的，这与数据库中分析的RASAL1在不同部位肿瘤中的表达不同相符，也可能是样本量小导致的误差，具体原因及机制还有待于大量实验验证。RASAL2基因的数据集有641个，样本数为78639个，有统计学差异的研究有23项。23项研究中，包括结直肠癌、食管癌、肾脏肿瘤及肺癌等多部位共10项研究显示RASAL2表达降低，在乳腺癌、结直肠癌及胃癌等多部位共13项研究显示RASAL2表达增加。RASAL2在结直肠癌中的文献报道既有高表达的也有低表达的，这与数据库的结果符合，猜测RASAL2的表达差异可能与肿瘤亚型相关。对17项关于NSCLC组织和正常组织中RASAL2的研究深入分析发现，RASAL2在NSCLC中表达降低，这与Li等[29]的研究结果一致。综上，我们得出RASAL1和RASAL2的表达在不同肿瘤中存在差异，在同一肿瘤中可能还与肿瘤亚型相关；在NSCLC中，RASAL1表达增加，RASAL2表达降低。Kaplan-Meier Plotter数据库分析表明，低表达的RASAL1和高表达的RASAL2与NSCLC患者的良好预后相关，结合RASAL1和RASAL2在NSCLC中的表达水平，猜测RASAL1可能在NSCLC中起促进癌发生的作用，而RASAL2可能作为抑癌基因而存在。进一步分析，RASAL1在鳞癌和腺癌中均与患者预后相关，RASAL1的表达可能不与NSCLC的病理类型相关；RASAL2只在腺癌中与患者生存预后相关，RASAL2可能与NSCLC的病理类型相关，亦或样本量小(271个样本)引起的实验误差。此外，低表达的RASAL1与接受放化疗的NSCLC患者的良好预后相关(RASAL2样本量小无法分析)，表明RASAL1可能是潜在的治疗靶点；RASAL1和RASAL2在早期患者中的表达与生存预后相关，表明其可能在疾病的早期发挥作用，但仍需大量的研究来验证。

总之，在NSCLC中，RASAL1高表达，RASAL2低表达，且低表达的RASAL1和高表达的RASAL2与早期患者良好的临床预后相关，故猜测RASAL1在NSCLC的早期形成中可能起促进作用，RASAL2起抑制作用。RASAL1对NSCLC患者预后的影响还与放化疗相关，其可能是改善辅助治疗的重要靶点。RASAL1和RASAL2可能是NSCLC诊断、治疗及预后评估的潜在生物标志物，但限于数据库的研究范围及样本量，上述猜测还有待于进一步的研究。