窒息对新生儿激素水平及其受体表达的影响

李军胜，刘丽芳

(1.丽水市妇幼保健院新生儿科，浙江 丽水 323000；2.丽水市妇幼保健院儿童保健科，浙江 丽水 323000)

窒息是新生儿致残和致死的主要原因之一，可导致脑、心脏、肝脏和胃肠等多个器官的功能损害[1]，使得脏器和组织出现缺氧、缺血，从而导致机体处于应激状态，其中新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)最为多见[2-3]。本研究检测了窒息对新生儿血清糖皮质激素(glucocorticoid，GC)、褪黑素(melatonin，MT)、糖皮质激素受体(GR-α mRNA)和褪黑素受体(MR-1 mRNA)的表达，旨在为揭示MT与下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA)轴的相关性提供研究基础，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2015年1月至2017年12月丽水市妇幼保健院收治的足月窒息新生儿90例作为研究对象。纳入标准：①孕37～40周分娩；②日龄为0～1d；③新生儿体重为2 500～4 000g；④新生儿窒息符合中华医学会围产医学分会新生儿复苏学组制定的《新生儿窒息诊断的专家共识》[4]。排除标准：①孕母为妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病和代谢性疾病等；②胎儿宫内发育良好；③围产期抑郁症。

根据Apgar评分[4]将90例新生儿分为轻度窒息组(Apgar评分为4～7分，n=41)和重度窒息组(Apgar评分为0～3分，n=49)。另外，选择同期在本院分娩的40例非窒息健康足月新生儿作为对照组。本研究已通过我院伦理委员会批准，所有新生儿监护人均知情同意。

1.2 新生儿窒息的治疗

一般支持治疗：维持水电解质和酸碱平衡，控制血糖和血压；降颅压：用20%甘露醇和呋塞米治疗；控制惊厥：用苯巴比妥治疗，负荷剂量为20mg/kg，12h后维持5mg·kg-1·d-1；营养脑细胞：单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液。

保持环境舒适，入院时放置在环境设备配备一致、无陪护的新生儿室，除非必要检查，否则不带出病房。

1.3 标本的采集

新生儿出生24h内和第7天时，采集新生儿晨起肘静脉血5mL置于EDTA管中，2h内低温离心(2 000r/min)15min，取上清待测，置于-70℃冰箱保存。

1.4 方法

1.4.1 血清GC和MT水平的检测

采用酶联免疫吸附试验检测血清中GC和MT的浓度[5]，试剂盒购于上海笃玛生物科技有限公司，批号分别为DM00436和DMX0601。检测步骤严格按照说明书进行操作，做3个副孔，最后在elx800酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)上检测，波长设置为450nm。检测完成后绘制标准曲线，根据OD值求样本浓度。

1.4.2 GR-α mRNA和MR-1 mRNA的检测

采用实时定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测mRNA的表达情况。①外周血中单个核细胞的提取。采用PBS缓冲液按1∶1稀释离心血，加入淋巴细胞分离液(批号P8610，索莱宝)4mL，离心(1 500r/min)30min，取上层液(白色云雾状)，加入2倍体积的PBS，离心(1 500r/min)10min，弃去上清液，加入TRIZOL 1mL，混匀待测。②单个核细胞mRNA的提取。将单个核细胞混合液离心(12 000r/min)5min，取上清加入氯仿200μL，振荡15s，静置5min，离心(12 000r/min)10min，吸取上层水相加入异丙醇500μL，冰上静置10min，离心(12 000r/min)10min，弃上清，加入75%乙醇1mL混合，离心(8 000r/min)5min，弃上清，加入无水乙醇1mL混匀，再离心(8 000r/min)5min，弃上清，温室晾干。③mRNA反转录成cDNA。引物由天根生化科技(北京)有限公司设计并提供，见表1。PCR反应体系为2xSYBR PCR minister Mix(10μL)、引物(0.5μL)、Deionized water(7μL)和cDNA(2μL)。PCR反应条件：第1步，95℃ 30s；第2步，95℃ 5s、60℃ 20s，共40个循环。PCR扩增结束后，绘制熔解曲线，以2-ΔΔCt值表示miR-124的相对表达水平[6]。

表1 引物序列

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组一般资料的比较

三组一般资料的比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，说明组间可比，见表2。

表2 三组一般资料的比较结果

2.2 各组血清GC、MT、GR-α mRNA和MR-1 mRNA表达水平的比较

对照组出生24h内与出生第7天血清GC、MT、GR-α mRNA、MR-1 mRNA的表达水平差异均无统计学意义(均P>0.05)；轻度窒息组出生第7天与出生24h内比较，血清GC，GR-α mRNA水平显著下降，血清MT，MR-1 mRNA水平显著上升，差异均有统计学意义(均P<0.05)；重度窒息组出生第7天与出生24h内比较，血清GC水平显著降低，MT、GR-α mRNA和MR-1 mRNA水平显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表3。

表3 血清GC、MT浓度和GR-α mRNA、MR-1 mRNA表达水平的比较结果

注：*为三组出生24h内的比较；**为三组出生第7天的比较。

组间两两比较采用LSD检验：

在出生24h内，轻度窒息组与对照组相比，血清GC、GR-α mRNA、MR-1 mRNA水平均显著升高(P值分别为0.000、0.000、0.000)，MT水平显著降低(P=0.000)；在出生第7天，轻度窒息组与对照组相比，血清MT、MR-1 mRNA水平均显著升高(P值分别为0.000、0.000)，GC和GR-α mRNA水平与对照组差异均无统计学意义(P值分别为0.484，0.444)。

在出生24h内，重度窒息组与对照组相比，GC和MR-1 mRNA水平均显著高于对照组(P值分别为0.000、0.000)，MT和GR-α mRNA水平均显著低于对照组(P值分别为0.000、0.000)；在出生第7天，重度窒息组与对照组相比，血清GC、MT、MR-1 mRNA水平均显著高于对照组(P值分别为0.000、0.000、0.000)，两组GR-α mRNA水平差异无统计学意义(P=0.387)。

在出生24h内，重度窒息组与轻度窒息组相比，GC和MR-1 mRNA水平均显著高于轻度窒息组(P值分别为0.000、0.000)，MT和GR-α mRNA水平均显著低于轻度窒息组(P值分别为0.000、0.000；在出生第7天，重度窒息组与轻度窒息组相比，血清GC、MT、MR-1 mRNA水平均显著高于轻度窒息组(P值分别为0.000、0.000、0.000)，两组GR-α mRNA水平差异无统计学意义(P=0.462)。

3 讨论

3.1 HPA轴与MT、MR的关系

重度HIE常引起新生儿死亡，存活者多遗留癫痫、精神发育迟滞等后遗症，给家庭和社会带来了沉重负担[7]。目前窒息所致HIE的发病机制尚未完全明了。机体受到应激时，HPA轴会激活，促进GC的分泌和释放，从而产生一系列的神经内分泌反应，以避免组织损伤，而缺血缺氧会使HPA轴调节紊乱[8]。GC分泌具有节律性，最高浓度在6∶00—8∶00时出现，此后逐渐减少，最低浓度出现在22∶00—2∶00时，然后逐渐增加[9]。这恰好与松果体分泌的褪黑素MT的节律相反[10-11]。可见MT与HPA轴有一定的相关性。根据Yang等[12]的动物研究发现，中重度脑损伤后机体处于应激状态，血清中GC水平升高、GR-α和MR-1表达下降，这不利于机体对抗应激，而使用外源性MT干预可缓解这种状态[13]。

3.2 窒息对GC和GR-α的影响

本研究发现，出生24h内轻度窒息组新生儿血清GC水平高于对照组，而重度窒息组高于轻度窒息组和对照组，提示窒息可使新生儿机体HPA轴处于兴奋状态，并且兴奋性可能与窒息的严重程度有关；而第7天时，轻度窒息组GC与对照组比较无差异，而重度窒息组GC虽然较出生24h内有所下降，但其水平仍高于对照组和轻度窒息组，结果表明轻度窒息新生儿经过治疗后应激可能恢复至正常水平，而重度窒息可能对新生儿的损伤较为严重，HPA处于持续激活状态，使机体分泌更多的GC以保护组织。

通过采用实时定量PCR技术检测GR-α mRNA的表达，发现轻度窒息组出生24h内GR-α mRNA水平明显较对照组高，而重度窒息组则较对照组和轻度窒息组低；第7天时，轻度窒息组和重度窒息组GR-α mRNA水平与对照组相当，这与HPA的反馈调节机制有关[14-15]，这与王莹等[16]研究结果一致。

3.3 窒息对MT和MR-1 mRNA的影响及本次研究的局限性

本研究发现，出生24h内轻度窒息组和重度窒息组的MT明显较对照组低，第7天时均明显升高。轻度窒息组和重度窒息组的MR-1 mRNA在出生24h内和第7天时均高于对照组，结果提示机体可能利用MT来抗应激，抑制GR-α mRNA，缓解HPA轴调节紊乱。Olegário等[17]对49例遭受围生期应激的小儿进行尸检，发现脑组织中MR表达水平升高，并且其表达水平与白细胞介素-1和C-反应蛋白呈正相关，说明MT可能参与调节免疫系统。

本研究的局限性在于：①本资料为观察性研究，未对机制进行研究；②仅从RNA水平进行检测，未检测蛋白；③新生儿窒息的治疗未严格控制，个体治疗的差异性可能影响研究结果。

3.4 结语

综上，窒息使新生儿机体HPA轴激活，重度窒息使HPA轴发生紊乱。MT和MR-1 mRNA可能通过调节HPA轴发挥抗应激作用，未来需要进一步进行机制研究。