LncRNA C2-AS1通过DNA错配修复相关通路抑制卵巢癌研究

雷 静，黄 玮

(宝鸡市妇幼保健院，陕西 宝鸡 721000)

卵巢癌是一类发病于卵巢内或卵巢上的恶性肿瘤，在女性生殖器官肿瘤中，发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌[1]。由于其发病较为隐匿，缺乏典型症状，难以早期发现，导致相当一部分患者失去了早期治疗的机会[2]，广泛的盆腔和腹腔转移极大地限制了治疗手段，使得其成为了全球范围内女性癌症死亡的第4位常见原因[3]。有研究证实，lncRNA在DNA错配修复(MMR)过程中也发挥了效用，同时，lncRNA也被报道与卵巢癌的进展有关[4]。本文通过检测lncRNA C2-AS1表达水平，探究其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料

收集2015年1月至2017年12月在宝鸡市妇幼保健院手术切除的卵巢癌标本，共23例。其中，19例患者年龄在60周岁以上，4例患者年龄不足60周岁，平均年龄(57.38±8.52)岁；pcTNM肿瘤分期：T1期1例，T2期10例，T3期12例；N0期2例，N1～3期21例；均为M0。所有23例标本均为配对的肿瘤及癌旁组织。本研究已通过医院伦理委员会审批，患者已签署知情同意书。

1.2 RNA测序

在手术后1h内获取患者标本，在-80℃下转运和保存，24h内将样品送至上海市吉凯基因科技有限公司，由该公司进行RNA测序及结果输出。

1.3 TCGA数据库

TCGA数据库是一个开放的公共数据库，其内含400余例卵巢癌基因表达数据及预后数据，网址为https:∥cancergenome.nih.gov/。本研究使用其中数据后利用R 3.4.0和Prism7进行基因相关性分析及预后分析。

1.4 统计学方法

采用Prism 7、R 3.4.0进行数据分析和处理，使用R Studio搭载和运行R 3.4.0。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LncRNA C2-AS1是卵巢癌中低表达的lncRNA

通过对23对卵巢癌肿瘤及癌旁组织RNA-seq测序数据分析，鉴定出卵巢癌中差异表达的基因列表，共2 622个，其在染色体上的定位见图1A。通过对这些基因进一步进行差异表达分析，选取signal to noise>0.3、P<0.001为界值鉴定出的肿瘤组织内差异表达的前50位基因，其中，lncRNA C2-AS1排名第四，在肿瘤组织中呈现低表达趋势，是前50位差异表达基因中唯一一个lncRNA。左侧绿色样本为癌旁组织，右侧红色样本为肿瘤组织，见图1B。

2.2 LncRNA C2-AS1相关基因富集于DNA错配修复通路

通过对2 622个基因进行WGCNA富集分析，可见纳入分析的卵巢癌组织样本无离群值，见图2A。确定软阈值后分步法构建模块，最终构建一个含有12个模块的差异基因加权共表达网络模型，不同的模块使用不同的颜色标识，其中，灰色模块内是难以归类的零散基因，见图2B。LncRNA C2-AS1被富集于黄色模块中，对模块内基因进行KEGG通路富集分析，发现这些基因被富集于DNA错配修复相关通路，见图2C。

注：B图左侧绿色样本为癌旁组织，右侧红色样本为肿瘤组织。

图1卵巢癌内高表达基因热点图

Fig.1 Gene heatmap in ovarian cancer

图2 LncRNA C2-AS1功能预测

2.3 LncRNA C2-AS1与DNA错配修复相关基因表达密切相关

选取了DNA错配修复相关基因BRCA1、BRCA2、PD-L1(CD274)、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2进行相关性分析，考虑到样本量较小难以获得可靠结果，使用TCGA数据库数据，结果显示，lncRNA C2-AS1与这些基因都有较好的相关性，见图3。

图3LncRNAC2-AS1与DNA错配修复相关基因的表达正相关

Fig.3 LncRNA C2-AS1 was positive correlated with DNA mismatch genes

2.4 低表达lncRNA C2-AS1导致卵巢癌患者预后较差

上述结果证明了lncRNA C2-AS1在卵巢癌组织中呈低表达，并且同DNA错配修复关系密切。选取TCGA数据库进行了预后分析，结果显示，低表达lncRNA C2-AS1导致了较差的卵巢癌预后，见图4。

图4 低表达lncRNA C2-AS1导致较差的卵巢癌预后

3 讨论

3.1 LncRNA C2-AS1是卵巢癌中的抑癌lncRNA

卵巢癌严重威胁女性的生命健康，但是，其发生发展因素目前仍十分模糊，导致其难以得到早期诊断和治疗。影响卵巢癌发病的风险因素包括激素水平、遗传背景、环境因素和年龄等多种因素。长链非编码RNA(lncRNA)是一类不编码蛋白质的长度超过200nt的RNA。既往大量研究显示，许多非编码RNA和肿瘤的发生发展关系密切，例如，lncRNA MALAT1通过PI3K-AKT通路促进卵巢癌细胞生长及转移[5]，有研究报道，miRNA-124同卵巢癌进展和转移关系密切[6-7]。同时，某些lncRNA同DNA错配修复有关，例如，lncRNA-XIST通过DNA错配修复相关通路调节胶质瘤化疗抵抗功能。

本研究利用对23对卵巢癌及癌旁组织的测序结果进行分析发现，lncRNA C2-AS1在卵巢癌中呈明显低表达，同时选用TCGA公共数据库对该lncRNA表达情况不同的患者进行了预后分析，结果显示低表达lncRNA C2-AS1患者预后明显较差，结果支持了该lncRNA可能是卵巢癌中的一种抑制肿瘤进展的lncRNA。但是，关于该lncRNA通过何种方式抑制卵巢癌进展尚无相关报道，因此，我们更进一步地进行了研究，利用WGCNA方法探索了lncRNA C2-AS1可能参与的通路，得到了一些有趣的结果。

3.2 LncRNA C2-AS1可能通过DNA错配修复相关通路调控卵巢癌进展

近年研究发现，DNA错配修复相关基因BRCA1和BRCA2突变的卵巢癌患者预后明显较未突变患者差，提示患者的遗传背景差异对于卵巢癌的预后和治疗靶点的寻找可能具有重要意义[8-9]。同时，有研究报道，DNA错配修复(MMR)是基因层面导致卵巢癌预后较差的重要因素，同时，MMR和多种肿瘤的发生发展有关[10-11]。但是，MMR是一个复杂的过程，仍未清楚其机制，目前有一些研究报道了其中的几种关键基因，包括BRCA1、BRCA2、PD-L1(CD274)、MSH2、MSH6、MLH1、PMS2等[12-16]。包含但不限于这些基因的共同作用，保证了MMR的正常运行，抑制肿瘤的发生发展。

本研究对23对肿瘤及癌旁组织测序数据进行WGCNA后，我们发现，lncRNA C2-AS1共表达基因被显著富集于DNA错配相关通路上，以上提到的关键基因基本都囊括在内。为了研究lncRNA C2-AS1与这些基因的关系，我们选用了样本量较大的TCGA数据库对它们做了相关性分析，结果显示，该lncRNA同这些基因都呈现显著的正相关关系，更进一步地提示了lncRNA C2-AS1可能通过影响这些基因的表达或功能从而参与DNA错配修复的过程，影响卵巢癌的进展。但是，尚未对该lncRNA及这些基因进行功能学及分子生物学实验验证，后期需要跟进更多的工作完善及证实相关理论。

综上所述，本研究通过利用高通量二代测序技术检测患者肿瘤及癌旁组织内的基因表达情况，筛选卵巢癌中差异表达的lncRNA，预测其功能，寻找在MMR过程中发挥作用的lncRNA并验证其与MMR相关基因表达的相关性。本研究首次提出了lncRNA C2-AS1低表达导致卵巢癌预后较差，同时lncRNA C2-AS1与MMR通路及其相关基因表达密切关联。本研究为探讨卵巢癌的发病机制提供了新的理论研究结果，为建立卵巢癌的临床治疗和评估预后靶点提供了新的思路。