2015—2018年四川地区无菌体液细菌的分布及耐药性分析

钟敏 龙姗姗 黄湘宁 杨永长 殷琳 张凯 喻华

(四川省医学科学院/四川省人民医院检验科，成都 610072)

近几年随着医疗技术的发展，介入性检查和治疗手段的广泛运用，无菌体腔的感染越来越受到临床医生的重视。目前，国内外有关分离来自无菌体液的病原菌耐药性综合分析报道较少，细菌的耐药性也存在地域差异和动态变迁，为了及时监测四川地区无菌体液细菌的分布及对常用抗菌药物的耐药情况，指导临床合理使用抗菌药物，本文对2015—2018年四川省细菌耐药监测网包括全省87家医院分离的无菌体液(未包括血液)细菌数据进行回顾性分析，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 细菌来源

收集2015—2018年四川省细菌耐药监测网所属87家医院临床无菌体液标本(不包括血液标本)中分离的非重复细菌29754株。

1.2 细菌鉴定及药敏试验

细菌鉴定和药敏试验采用VITEK系统、API系统、BD100系统、贝克曼系统、迪尔系统、赛默飞系统、西门子系统和美华系统等或手工方法进行细菌鉴定和药敏试验，药敏试验参照2018年美国临床实验室标准化协会(Clinical Laboratory Standard Institute,CLSI)[1]推荐的药敏试验方法进行，采用纸片扩散法、E-test法或自动化仪器法，药敏纸片使用杭州滨和、康泰或Oxoid公司生产的商品。质控菌株包括大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218、粪肠球菌ATCC29212、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC29213、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎链球菌ATCC49619和流感嗜血菌ATCC49247等。药敏判读标准参照CLSI指南(2018版)[1]细菌药敏折点进行结果判读，其中头孢哌酮/舒巴坦参照头孢哌酮折点标准判读。质控菌株药敏结果在控，研究菌株结果方可纳入数据分析。所得结果用WHONET 5.6软件进行分析。

1.3 特殊耐药细菌检测复核

1.3.1 青霉素不敏感肺炎链球菌的检测

经苯唑西林纸片(含1μg)法测定抑菌圈直径≤19mm的肺炎链球菌菌株，采用青霉素E-test试条测定其最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)，脑膜炎株和非脑膜炎株分别按CLSI 2018年标准判定为青霉素敏感、中介或耐药株。

1.3.2 耐万古霉素肠球菌检测

经万古霉素纸片法或自动化仪器法测定结果为不敏感株者，用万古霉素E-test试条测定MIC值。

1.3.3 耐碳青霉烯肠杆菌科细菌(CRE)检测

将其定义为对亚胺培南、美罗培南、多利培南或厄他培南中任一药物耐药的肠杆菌科细菌(普罗威登菌、变形菌、摩氏摩根菌对亚胺培南耐药除外)。仪器法出现CRE菌株需用亚胺培南、美罗培南、多利培南或厄他培南纸片法进行确认。

1.3.4 产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)菌株的检测

按CLSI 2018推荐的纸片法筛选和仪器法检测大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌中的产ESBL菌株。

1.4 统计学处理

药敏结果判断标准按CLSI 2018年标准，所有数据采用WHONET 5.6软件剔除重复株后进行统计分析。

2 结果

2.1 细菌分布及标本来源

2015—2018年共收集无菌体液分离的细菌共29754株，其中革兰阳性菌11351株，占38.1%，革兰阴性菌18403株，占61.9%。革兰阴性菌中分离率第一位的是大肠埃希菌，占30.8%(9163/29754)，其次为肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌，分别占8.7%(2587/29754)和4.9%(1459/29754)。革兰阳性菌中，排在前3位的依次为金黄色葡萄球菌占6.2%(1844/29754)、屎肠球菌占6.1%(1823/29754)和粪肠球菌占4.3%(1291/29754)(表1)。其中28.0%的菌株分离自腹水，其余依次分离自胆汁25.1%、胸水8.3%、脑脊液6.6%、羊水4.1%等。无菌体液标本的细菌分布见表1。

2.2 革兰阳性菌对抗菌药物的耐药性

2.2.1 葡萄球菌对抗菌药物的耐药性

本研究中无菌体液标本共检出金黄色葡萄球菌株1844株和凝固酶阴性葡萄球(CNS)3443株，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCNS)平均检出率分别为28.3%(522/1844)和63.9%(2199/3443)。MRSA和MRCNS对β-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类和喹诺酮类的耐药率显著高于MSSA和MSCNS；尚未发现对万古霉素和利奈唑胺耐药的葡萄球菌；替加环素也未出现耐药菌株。葡萄球菌对抗菌药物的耐药性见表2。

表1 无菌体液标本的细菌分布Tab.1 Distribution of bacterial species from sterile body fluid specimens

2.2.2 肠球菌属细菌对抗菌药物的耐药性

无菌体液标本中分离出1823株屎肠球菌和1291株粪肠球菌，屎肠球菌对测试的抗菌药物耐药率显著高于粪肠球菌，但对四环素的耐药率低于屎肠球菌，分别为44.2%和51.2%。其中屎肠球菌中分别检出0.5%(9株)对利奈唑胺耐药和2.2%(40株)对万古霉素耐药的菌株，粪肠球菌中发现1.7%(22株)对利奈唑胺耐药和0.3%(4株)对万古霉素耐药的菌株。肠球菌属对抗菌药物的耐药情况见表3。

2.3 革兰阴性菌对抗菌药物的耐药性

2.3.1 肠杆菌科细菌

无菌体液标本分离的肠杆菌科细菌排在前3位的依次为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌。其中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBL的平均检出率(不包括同时产AmpC酶及碳青霉烯酶的菌株)为45.8%和25.6%。

大肠埃希菌对氨苄西林、头孢呋辛、头孢噻肟和复方磺胺甲噁唑耐药率较高均在50.0%以上，仅对碳青霉烯类、阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和替加环素的耐药率低于10.0%；肺炎克雷伯菌耐药率稍低，除了对氨苄西林和氨苄西林/舒巴坦的耐药率高于30%，第三、四代头孢菌素类、β-内酰胺酶抑制剂类、氨基糖苷类、喹诺酮类、碳青霉烯类抗菌药物对肺炎克雷伯菌的仍保持较高的抗菌活性；对碳青霉烯类的耐药率略高于大肠埃希菌，耐药率为4%～7%。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌主要耐药性见表4。

表2 无菌体液中葡萄球菌属对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.2 Drug resistance and susceptibility of Staphylococcus strains isolated from sterile body fluids to antimicrobial agents

表3 无菌体液中粪肠球菌和屎肠球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.3 Drug resistance and susceptibility of E.faecalis and E.faecalis strains isolated from sterile body fluids to antimicrobial agents

2.3.2 非发酵菌对抗菌药物的耐药性

表4 无菌体液中肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.4 Drug resistance and susceptibility of Enterobacteriaceae bacteria isolated from sterile body fluids to antimicrobial agents

无菌体液标本中铜绿假单胞菌对各种抗菌药物的耐药率在2%～24%，其中对阿米卡星的耐药率最低(2%)。鲍曼不动杆菌对替加环素(2.1%)和米诺环素(27.2%)和头孢哌酮/舒巴坦(39.7%)的耐药率较低；对其他测试抗菌药物的耐药率均在49%以上。铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌主要耐药性见表5。

2.4 耐药率变迁

2.4.1 金黄色葡萄球菌耐药率变迁

2015—2018年间无菌部位分离的金黄色葡萄球菌对万古霉素、利奈唑胺、替考拉宁保持高度敏感，对庆大霉素、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑和四环素耐药率相对较低，呈逐年相对降低趋势。利福平、克林霉素、红霉素的耐药率则变化不大，保持在较稳定水平。2018年MRSA的检出率较前几年有所下降。金黄色葡萄球菌药率变化见表6。

2.4.2 屎肠球菌耐药率变迁

2015—2018年间无菌部位分离的屎肠球菌数量呈逐年增加的趋势，耐万古霉素率由4%降至1.8%，而耐利奈唑胺率由1.3%降至0，对万古霉素和利奈唑胺的敏感性较高，保持在95%～99%；对氨苄西林、喹诺酮类的耐药率比较接近，均在65%以上，呈相对增高趋势。其余抗菌药物耐药率变化不明显。屎肠球菌药率变化见表7。

2.4.3 大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药率变迁

表5 无菌体液中铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.5 Drug resistance and susceptibility of P.aeruginosa and A.baumannii isolated from sterile body fluids to antimicrobial agents

表6 金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.6 Drug resistance and susceptibility of S.aureus to antimicrobial agents

表7 屎肠球菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.7 Drug resistance and susceptibility of E.faecalis to antimicrobial agents

大肠埃希菌对头孢哌酮/舒巴坦耐药率由5.85%增加到了7.6%；对碳氢霉烯类、阿米卡星、哌拉西林/三唑巴坦、替加环素保持较高活性，耐药率变化整体不大，保持在0.4%～4.4%之间；氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、第三代头孢菌素、第四代头孢菌素、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星和复方磺胺甲噁唑耐药率呈相对下降趋势，但耐药率保持在40%以上。大肠埃希菌耐药率变化见表8。

肺炎克雷伯菌对碳氢霉烯类的耐药率呈增加趋势，由2.7%增加到12.1%；替加环素的耐药率由0增加到6.6%；对头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦、阿米卡星的耐药率保持较低(＜8%)，变化不大。肺炎克雷伯菌耐药率变化见表9。

2.4.4 铜绿假单胞菌耐药率变迁

铜绿假单胞菌对头孢他啶、亚胺培南和美罗培南的耐药变化明显，呈逐年下降的趋势，由最高22.7%降至12.6%；氨曲南、氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗生素耐药率也有所下降，其余变化不明显。铜绿假单胞菌耐药率变化见表10。

3 讨论

2015—2018年间，四川地区临床71家医院无菌体液标本(未包括血液)中共分离出共29754株细菌，约28.0%的菌株分离自腹水，分离自胆汁25.1%、胸水8.3%、脑脊液6.6%、羊水4.1%等，与朱任媛等[2]报道的胆汁分离细菌数最多有所不同。无菌体液中分离的革兰阴性菌检出率61.9%，显著高于革兰阳性菌的检出率38.1%，与2012年CHINET监测数据革兰阴性菌检出率56.1%相比，革兰阴性菌检出率稍高。革兰阴性菌中检出率排在前3位的依次是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌；革兰阳性菌中检出率排在前3位依次是金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、表皮葡萄球菌；与国内报道[3]不同的是凝固酶阴性葡萄球菌的分离比率明显降低，可能与各医院采集标本无菌操作意识增强后标本污染减少有关。

表8 大肠埃希菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.8 Drug resistance and susceptibility of E.coli to antimicrobial agents

表9 肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.9 Drug resistance and susceptibility of K.pneumoniae to antimicrobial agents

表10 铜绿假单胞菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Tab.10 Drug resistance and susceptibility of P.aeruginosa to antimicrobial agents

本次监测结果显示：MRSA和MRCNS的检出率分别为28.3%和63.7%，其结果显示明显低于2017年CHINET的全国监测数据[4]。同时2018年MRSA的检出率较前3年有所下降，这可能与近年来我省各医院采取了相关干预措施有一定关系：一方面严格实施MRSA的主动筛查，加强护理管理，切断耐药菌传播途径；另一方面我省大多数医院在各病区通过细菌耐药监测数据掌握其耐药动态，指导临床合理使用抗生素。从表6结果显示，金黄色葡萄球菌2015—2018年间无菌部位分离的金黄色葡萄球菌对万古霉素和利奈唑胺仍保持高度敏感(100%)，目前万古霉素仍是治疗MRSA感染的一线用药。

无菌体液中肠球菌其分离率在阳性菌中仅次于金黄色葡萄球菌，其检出率排在了第4位，从表3结果可以发现屎肠球菌对测试的抗菌药物耐药率显著高于粪肠球菌，粪肠球菌对氨苄西林仍保持较高的敏感性，耐药率为3.9%，屎肠球菌对氨苄西林耐药率为69.5%。利奈唑胺耐药粪肠球菌和屎肠球菌分别占1.7%和0.5%。万古霉素耐药粪肠球菌和屎肠球菌分别占0.3%和2.2%，略高于2017年CHINET[4]水平。考虑本研究纳入的医院主要为四川地区不同等级的医院，其结果可能会与实际情况有些偏差，需进一步完善对二级医院的数据研究，加强抗菌药物的合理使用和多重耐药菌的防控。另外近年来万古霉素等糖肽类抗菌药物的应用使耐万古霉素肠球菌(VRE)的分离率逐年增加。肠球菌对万古霉素等抗菌药物耐药程度不断增加主要是转座子、质粒等实现耐药机制累积的结果，因此对VRE的密切监测及控制VRE的播散具有重要的临床意义[5-6]。

监测结果显示肠杆菌科中的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌是无菌体液分离率最高的病原菌。在过去的10年中，碳青霉烯类依然是最强有力的抗肠杆菌科细菌药物，被认为是治疗耐药革兰阴性菌感染的最后一道防线。本次监测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南的耐药率分别为1.2%、1.9%、1%和4.8%、7%、4%。近4年来本地区大肠埃希菌对碳青霉烯类药物耐药率有所降低，而肺炎克雷伯菌则呈缓慢上升趋势，由3.6%增加到12.1%。研究表明KPC酶的产生是肠杆菌科细菌碳青霉烯类药物耐药的主要原因，该酶基因编码序列定位在质粒、整合子等可转移的基因元件上，可在不同菌种间水平传播[7]。表3结果显示大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对替加环素仍然保持较高的活性，目前对碳氢霉烯类耐药菌株仍然比较敏感，这与文献[8]报道的产酶KPC酶肠杆菌科细菌对多黏菌素类、替加环素仍较敏感一致。本研究厄他培南对肠杆菌科耐药率低于亚胺培南和美罗培南，一方面由于大部分医院使用梅里埃的Compact VETEK2仪器，针对肠杆菌科细菌该仪器设置了厄他培南中介和耐药会被自动屏蔽没有上传到数据中，需要使用其他方法进行验证，导致统计结果不准确；另外一方面，由于本次统计为四川整个地区所有耐药监测单位，每个医院硬件设施不同，使用的仪器和药敏卡片不同，有的单位药敏试验中未包括厄他培南，但有亚胺培南和美罗培南，故有可能导致厄他培南耐药率假性低于亚胺培南和美罗培南。

非发酵菌中铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率为14.5%；鲍曼不动杆菌对包括碳青霉烯类在内的大多数监测药物耐药率超过60.0%，但对替加环素和米诺环素仍有较好的抗菌活性。铜绿假单胞菌对碳青霉烯的耐药率均低2017 CHINET水平，而鲍曼不动杆菌对碳青霉烯的耐药率与2017 CHINET水平一致[4]。鲍曼不动杆菌在神经外科、重症监护和外科阴性菌中居首位，由于这些患者多存在严重复发病及免疫功能低下，且多数接受了侵入性操作及预防性用药，增加了感染泛耐药鲍曼不动杆菌的风险。

综上所述，本地区无菌体液分离细菌对常见抗菌药物的耐药率部分仍呈增长趋势，尤其是碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌。非发酵菌特别是鲍曼不动杆菌的耐药形势严峻。应充分利用本地细菌耐药监测结果进行感控管理，促进抗菌药物合理应用。