基于表达谱芯片探索地五养肝胶囊防治肝癌的生物信息分析*

王明刚 陈 乞 高 翔 叶之华 肖明中 李瀚旻,△

1.湖北中医药大学中医临床学院 (湖北 武汉, 430065) 2.湖北省中医院 3.湖北省中医药研究院

原发性肝癌(PLC)是我国常见恶性肿瘤，肝细胞癌(HCC)是其主要类别，在全部恶性肿瘤中顺位死亡率中已上升至第2位，占全球PLC死亡率的51%左右[1, 2]。在我国HBV感染相关HCC占绝大部分。考虑到庞大的HBsAg阳性感染率，肝癌人口标化率(中标率)呈逐步上升趋势[3]。总体上看HCC具备发病隐匿、高发病率、高死亡率、高年增率的特性，是学术界公认的重大疑难疾病[4]。

如何切实有效地提高肝癌临床治疗效果是学术界面临的巨大挑战，中医肝病专家李瀚旻教授提出 “髓失生肝”的肝癌病理机制，形成“补肾生髓成肝”防治肝癌的治疗法则[5]。凝练为地五养肝胶囊(由熟地、五味子、姜黄、茵陈、甘草等组成)这一经典方药，临床研究证实地五养肝胶囊能显著降低肝硬化发生率，改善肝再生微环境，降低肝癌发生率和肝癌发生风险[6]。机制研究发现该方能影响JAK/STAT、Ras/Raf/Mek/Erk信号通路相关蛋白表达，抑制骨髓干细胞转化肝癌干细胞，促进肝细胞再生修复，改善肝再生微环境而抑制肝癌发生发展[5]。为深入探索地五养肝胶囊防治肝癌的分子机制，构建地五养肝胶囊防治肝癌的生物信息网络，本研究将采用Solt-Farber二步法构建肝癌大鼠模型，地五养肝胶囊干预治疗，收集肝癌组织，采用表达谱芯片检测，提取mRNA差异表达信息进行生物信息学综合分析，为深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 4～5周龄SD雄性大鼠，SPF级，体重(150±50)g，由湖北省疾病预防控制中心提供；二乙基亚硝胺(DEN)及二乙酰氨基芴(2-AAF) 购于sigma公司，地五养肝胶囊(批号：鄂药制药字Z20113160)由湖北省中医院肝病研究所提供。

1.2 造模方法 雄性SPF级SD大鼠，48只，4-5周龄，体重(150±50)g。大鼠按随机数字法分为空白对照组(Normal)、模型组(Model)、地五养肝治疗组(DWYG)每组16只。造模第1天，模型组与地五养肝治疗组按50mg/kg的剂量一次性腹腔注射二乙基亚硝胺(DEN)作为启动剂，2周后均按15mg/kg/d剂量予以二乙酰氨基芴(2-AAF)灌胃7天，第3周末行2/3肝部分切除术(PHx)，切除肝左叶和中叶。地五养肝治疗组于造模期间按750mg/kg/d剂量给予地五养肝胶囊水溶液灌胃、空白对照组则给予等量生理盐水灌胃对照。

1.3 标本收集与芯片检测 成模后地五养肝胶囊中药干预16周，16周后即时处死各组大鼠，取肿瘤组织，Trizol法提取总RNA，测定RNA浓度，全部芯片检测样本均质量控制合格，使用Arraystar RNA Flash Labeling Kit对样本进行标记，使用Agilent SureHyb进行杂交实验。使用Agilent GeneSpring GX v12.1进行芯片标准化操作，挑选差异表达的mRNAs。topGO软件对差异mRNAs进行GO分析与PATHWAY分析。

2 结果

2.1 地五养肝胶囊可影响大鼠肝癌组织多个mRNA表达 以Fold Change>2，P<0.05为条件进行差异mRNA筛选，与模型组比较地五养肝胶囊下调481个大鼠mRNA表达，上调236个mRNA表达，差异表达聚类热图如下。

2.2 地五养肝胶囊调控的差异mRNA GO分析

2.2.1 地五养肝胶囊下调的mRNA GO分析 对地五养肝胶囊下调的481个mRNA进行GO分析，在生物学过程中可影响细胞损伤反应(化学应激)、细胞组织发育过程，循环系统(微血管育)发育等过程；在细胞组份中可影响细胞外基质、细胞外囊泡、细胞外膜结合、膜结合囊泡；生物学功能可影响蛋白质结合、钙离子结合、细胞粘附分子结合、生长因子结合、蛋白质同二聚体活性等功能。见表1。

2.2.2 地五养肝胶囊上调的mRNA GO分析 对地五养肝胶囊上调的236个mRNA表达进行GO分析，在生物学过程中可影响细胞间粘附、细胞内受体信号通路、类固醇激素反应、有机环状化合物反应等过程，在细胞组份中可影响离子通道复合体、跨膜转运复合体、突触膜、质膜区等细胞组份。在分子功能中可影响金属离子结合、序列特异性DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、类固醇激素受体等分子生物功能。见表2。

2.3 地五养肝胶囊调控的差异mRNA PATHWAY分析

2.3.1 地五养肝胶囊下调的mRNA PATHWAY分析 地五养肝胶囊下调的481个mRNA进行PATHWAY分析，发现其可影响紧密连接信号途径、造血细胞功能途径、胆汁分泌信号通路、肌动蛋骨架调节通路、ECM受体相互作用通路、细胞因子-受体相互作用通路等。见图1。

图1 地五养肝胶囊下调的mRNA PATHWAY分析

2.3.2 地五养肝胶囊上调的mRNA PATHWAY分析 地五养肝胶囊下调的236个mRNA进行PATHWAY分析，发现其可影响癌症转录失调信号通路、GnRH信号通路、糖酵解/糖异生信号通路、PPAR信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、TRP通道炎症介质调控信号通路等。见图2。

图1 地五养肝胶囊上调的mRNA PATHWAY分析

3 讨论

长期以来，肝癌的防治策略多集中在肿瘤细胞本身，外科手术切除、放疗、化疗均以有效清除或杀死肿瘤细胞为目标，随着对肝癌防治水平未见实质性提高的反思及对发病机制复杂性的深入认识，近年来在对肝癌发病机制及防治策略上逐步由着眼肝癌细胞本身向肝癌微环境方向转变，已形成新的肝癌防治策略[7]。肝癌微环境指非肝癌细胞和细胞外基质所共同构成的复杂混合物，从类别上区分，HCC微环境主要包括了纤维化微环境、血管微环境、免疫微环境、氧化微环境和干细胞微环境等。 这些微环境之间存在相互关联、相互影响的复杂关系[8]，但难以形成关键概念来统筹这些微环境的根本落脚点。肝病专家李翰旻教授提出肝癌异常肝再生微环境的基本概念[7,9]，认为HCC的发生与发展其本质是异常肝再生微环境的形成与维持过程，各种肝癌微环境可与肝再生异常微环境产生直接或间接的复杂影响关系，并提出基于“补肾生髓成肝”的中医药改善肝再生微环境防治HCC的治疗新策略，充分发挥中医药防治肝癌的多次层、多时限、整体、动态调控的疗效优势[10]。

表1 地五养肝胶囊下调的mRNA GO分析

地五养肝胶囊正是在“补肾生髓成肝”防治肝癌理论指导下形成的有效中药制剂，方中熟地滋阴补肾，五味子柔肝补肾，两药相合增强补肾之功；茵陈清热利湿而退黄，姜黄活血化瘀而通络，生甘草清热解毒。甘草与五味子清热养阴、酸甘化阴，全方共奏补肾养肝、利湿退黄、活血通络之效。前期研究已经证实该方具有防治肝癌发生与发展的临床治疗效果，本研究构建了大鼠肝癌模型，地五养肝胶囊进行干预处理，发现该方可上调肝癌组织236个mRNA表达，下调481个mRNA表达，体现出该方存在的多层次、多靶点、多途径发挥疗效机制的可能。在对地五养肝胶囊下调的481个mRNA进行GO分析中发现，该方可影响细胞损伤反应(化学应激)、循环系统(微血管)发育过程；影响细胞外基质、细胞外囊泡、细胞外膜结合等细胞组份；影响蛋白质结合、钙离子结合、细胞粘附分子结合、生长因子结合等功能。在对地五养肝胶囊上调的236个mRNA表达进行GO分析，在生物学过程中可影响细胞间粘附、细胞内受体信号通路、类固醇激素反应、有机环状化合物反应等过程，在细胞组份中可影响离子通道复合体、跨膜转运复合体、突触膜、质膜区等细胞组份。在分子功能中可影响金属离子结合、序列特异性DNA结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、类固醇激素受体等分子生物功能。综合分析，地五养肝胶囊可调控细胞损伤反应、循环系统(微血管)发育过程这可能与阻断肝脏肿瘤恶性增生及微血管新生存在关联，并且可影响肿瘤组织细胞外基质和细胞外囊泡传递等细胞组份及细胞间交流方式。

地五养肝胶囊下调的481个mRNA进行PATHWAY分析，发现其可影响紧密连接信号途径、造血细胞功能途径、胆汁分泌信号通路、肌动蛋白骨架调节通路、ECM受体相互作用通路、细胞因子-受体相互作用通路等相关。地五养肝胶囊下调的236个mRNA进行PATHWAY分析，发现其可影响癌症转录失调信号通路、GnRH信号通路、糖酵解/糖异生信号通路、PPAR信号通路、神经活性配体-受体相互作用信号通路、TRP通道炎症介质调控信号通路等。这些信号通路均与肝癌的发生与发展、侵袭与转移关系密切，深入探索地五养肝胶囊通过影响以上信号途径发挥的疗效机制有重要现实意义。