基于PI3K /Akt信号通路探讨抗纤抑癌方干预肝癌前病变的作用机制*

李 莹 叶永安 李志国 张露丹 杨先照

1.北京中医药大学东直门医院 (北京， 100700) 2.北京中医药大学肝病研究所

肝癌是一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤，数据显示，2014年我国肝癌新发病例约36.5万例，死亡病例约31.9万例[1]。尽管乙肝疫苗免疫接种及早期筛查等相关一、二级预防在我国已初见成效，但人口增长和老龄化加剧导致肝癌新发及死亡病例数量大幅增加。肝癌带来的疾病负担已成为危害我国人群健康的重要因素之一。此外，由于肝癌具有症状出现较晚、病情进展迅速、手术复发率高等特点，使得肝癌的有效治疗成为亟待解决的难题。这些都迫切要求肝癌的临床治疗及相关基础研究战略前移，因此，开展肝癌前病变的研究具有非常重要的现实意义。

肝癌前病变，是一种具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，是良性病变向恶性病变过渡的移行阶段，有高度恶变风险[2, 3]，如能阻断其病理进程，则可有效预防肝癌发生。抗纤抑癌方是叶永安教授多年来防治肝癌前病变的临床经验方，前期研究已证实该方可通过调控整合素α5β1信号通路改善大鼠肝脏纤维堆积及肝细胞异常增生[4, 5]。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K /Akt) 信号通路是整合素α5β1下游重要信号转导途径，在肝纤维化、肝硬化及肝癌的发生、发展过程中起着重要作用，但在肝癌前病变的研究中未见报道。本研究观察了抗纤抑癌方对肝癌前病变大鼠PI3K/Akt信号通路的影响，探讨其治疗肝癌前病变的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性10周龄Wistar大鼠85只，体重(180±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号:SCXK(京)2016-0006，饲养于北京中医药大学东直门医院屏障环境动物实验室。实验动物购买、饲养方案报经北京中医药大学东直门医院实验动物伦理委员会许可。

1.1.2 药品 抗纤抑癌方颗粒剂，由柴胡、黄芪、山药、白芥子等药物组成[培力(南宁)药业有限公司生产]；复方鳖甲软肝片(内蒙古福瑞中蒙药科技股份有限公司生产，批号：Z19991011)；二乙基亚硝胺(美国Sigma公司，货号：N0756)。

1.1.3 试剂与仪器 Anti-GSTP1(bs-2735R，北京博奥森生物技术有限公司)，PI3K p85抗体(#4292，美国CST公司)，Phospho-PI3K p85 (Tyr458)/p55 (Tyr199) 抗体(#4228，美国CST公司)，Akt抗体(#9272，美国CST公司)，Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP Rabbit mAb(#4060，美国CST公司)，GAPDH(ab9485，英国Abcam公司)；兔SP试剂盒(SP-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司)，DAB显色试剂盒(DA1010，北京索莱宝科技有限公司)，Trizol试剂盒(15596026，美国Invitrogen公司)，PCR引物(上海生工生物工程有限公司)，M-MLV反转录试剂盒(M1701，美国Promega公司)，Real-timePCR扩增试剂盒(北京中原领先科技有限公司)，Agarose(V2111，美国Promega公司)，DEPC(D5758，美国Sigma公司)，Real-Time PCR仪(7500，美国ABI公司)，4℃低温高速离心机(SORVALL Stratos，美国Thermo公司)，核酸蛋白测定仪(BioPhotometer，德国Eppendorf公司)，蛋白电泳槽(1658001，美国Bio-Rad公司)，半干转印槽(1703940，美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 按照Excel随机数字表法随机分为正常组10只，模型组、抗纤抑癌低、中、高剂量组及鳖甲软肝组每组各15只。正常组大鼠按0.4ml/l00g剂量给予生理盐水腹腔注射，其余各组大鼠按50mg/kg剂量予二乙基亚硝胺腹腔注射制备肝癌前病变模型，每周1次，共14周。

1.2.2 给药 第9周起，正常组和模型组大鼠给予蒸馏水灌胃，抗纤抑癌低、中、高剂量组分别予临床剂量4、7、14倍的抗纤抑癌方灌胃，鳖甲软肝组予临床剂量7倍的复方鳖甲软肝片灌胃，每次用药体积均为1ml/l00g，每天1次，连续给药6周。

1.2.3 取材 各组大鼠在实验第14周末取材。在末次给药24h后，配置10%水合氯醛溶液按照0.33ml/100g腹腔注射麻醉，开腹，于肝脏最大叶、距边缘约1cm的部位切取肝组织置于4%多聚甲醛中固定，另取肝组织快速置于液氮中以备Western blot、实时荧光定量PCR检测用。

1.2.4 检测指标及方法

1.2.4.1 免疫组化法检测大鼠肝组织中胎盘型谷胱甘肽转移酶(GST-Pi)的表达 取出固定好的标本，进行常规流程石蜡包埋，制成切片；脱蜡至水，PBS冲洗3min×3次；置抗原修复液中煮沸15min，PBS冲洗5min×2次；滴加3%过氧化氢一滴，室温孵育10min，PBS冲洗3min；加山羊血清封闭液一滴，放入湿盒内，室温10min；甩掉封闭液，滴加一抗(稀释度1：150)盖住组织，放入湿盒内4℃过夜；加二抗50μl，室温孵育10min，PBS冲洗3min×3次；滴加一滴链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10min，PBS冲洗3min×3次；DAB显色，显微镜下控制染色；苏木素复染，1～2min，细胞核变蓝色即可终止，自来水冲洗反蓝；常规脱水、透明、封片。显微镜下观察阳性细胞分布，阳性信号为胞浆被染成棕黄色，每组随机选取6张切片，每张切片取5个视野拍照，运用图像分析软件Image-Pro Plus6.0测量平均光密度(MOD)，取5个视野平均值代表每张切片的MOD值。

1.2.4.2 实时荧光定量PCR法检测大鼠肝脏组织中PI3K、Akt mRNA的表达 采用Trizol试剂提取总RNA，核酸紫外分光光度计测定经稀释的RNA提取物的OD值和浓度，判断RNA纯度，计算RNA浓度；用二步法进行mRNA表达的检测；按反转录按试剂盒说明书操作，取5μl总RNA，在反转录酶M-MLV和引物oligo(dT)15条件下进行反转录，得到cDNA链；以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR反应，反应体系为20μl，含2μlcDNA，10pmol/μl上下游引物各0.5μl，SYBRmix10μl，不足的体积以无RNA酶的水补齐；以GAPDH作为内参照，循环参数：预变性94℃×10min，变性94℃×15s，退火60℃×60s，延伸72℃×10min，共45个循环。所得Ct值按照2-△△Ct法均一化处理后进行统计。引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.4.3 Western blot法检测大鼠肝脏组织中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白的表达 将肝脏组织加蛋白裂解液进行匀浆裂解，按蛋白抽提试剂盒说明书提取总蛋白，Bradford法定量；把蛋白样品分装到离心管中，并加入上样缓冲液，沸水煮5min，4℃放置；制备12%SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶，各取5μl蛋白样品进行上样，电泳4～5h，转移至PVDF膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭，分别加入一抗(稀释度1∶1000)，4℃孵育过夜，TBST冲洗5～10min，反复3次，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔IgG(稀释度1∶5000)，室温孵育60min，洗去未结合的二抗，滴加化学发光剂ECL进行发光显影。灰度扫描后用ImageJ软件分析条带的灰度值，结果以各目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值的比值表示。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织中GST-Pi的表达情况 GST-Pi阳性灶表现为圆形或不规则形棕黄色团块，主要分布在细胞胞浆中。正常组(A)未见明显阳性表达，模型组(B)可见多处位于汇管区周围及肝小叶内的阳性灶，且染色较深；与模型组相比，抗纤抑癌低、中剂量组(C、D)及鳖甲软肝组(F)阳性表达面积减少，染色变浅；抗纤抑癌高剂量组(E)阳性表达面积则明显减少，染色减轻。见插页图1。采用IPP软件对其阳性表达MOD进行半定量分析，两两比较可见，模型组MOD值较正常组显著升高(P<0.01)，抗纤抑癌高剂量组MOD值较模型组显著降低(P<0.05)。见图2。

2.2 各组大鼠肝组织中PI3K、Akt mRNA的表达水平 见图3。与正常组相比，模型组PI3K、Akt mRNA的表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，抗纤抑癌低、中、高剂量组及鳖甲软肝组PI3K、Akt mRNA的表达均显著降低(P<0.01)；与鳖甲软肝组相比，抗纤抑癌低剂量组PI3K、Akt mRNA的表达升高(P<0.01或P<0.05)，抗纤抑癌高剂量组PI3K mRNA的表达显著降低(P<0.05)，抗纤抑癌高剂量组Akt mRNA的表达显著降低，但差异无统计学意义。

图2.各组大鼠肝组织GST-Pi平均光密度(MOD)

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与鳖甲软肝组比较，△P<0.05，△△P<0.01。下图同。

图3 各组大鼠肝组织中PI3K、Akt mRNA达结果

2.3 各组大鼠肝组织中PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt蛋白的表达水平 见图4。与正常组相比，模型组PI3K、p-PI3K及p-Akt蛋白的表达显著升高(P<0.01)；与模型组相比，抗纤抑癌低剂量组PI3K、p-PI3K蛋白表达显著降低(P<0.01或P<0.05)，抗纤抑癌中、高剂量组PI3K、p-PI3K及p-Akt蛋白的表达均显著降低(P<0.01或P<0.05)；与鳖甲软肝组相比，抗纤抑癌高剂量组p-PI3K蛋白的表达显著降低(P<0.05)。

图4 各组大鼠肝组织PI3K、p-PI3K、Akt及p-Akt 蛋白表达结果

3 讨论

肝癌前病变的实质是肝细胞异常增殖、分化及凋亡紊乱[6]，是肝纤维化、肝硬化进展为肝癌的重要阶段[7]。预防及阻断肝癌前病变的发生、发展，逐渐成为当前肝癌防治工作的重点。目前，在肝癌前病变的治疗方面还没有一个公认的疗效确切的上市药物，无论西医还是中医都处在同一条起跑线上，开展具有我国自主知识产权的中医药干预肝癌前病变研究具有重要战略意义。抗纤抑癌方是叶永安教授治疗肝癌前病变的经验方，由柴胡、黄芪、山药、白芥子等药物组成，具有调肝健脾、活血化痰之功，在临床上取得了较好的疗效。已完成的实验研究证实，抗纤抑癌方可减轻肝癌前病变大鼠的肝细胞变性坏死、结缔组织增生和肝细胞异型增生程度，降低 GST-Pi、PCNA、AFP的表达，抑制HSC活化，调控 MMP-1、 COX-2及 TIMP-1 表达，从而促进细胞外基质降解、抑制肿瘤血管生成[8, 9]。

在肝癌前病变的研究中，GST-Pi是目前公认的癌前指标，在许多恶性肿瘤中均有不同程度地表达，特别是在癌前病变及分化较好的肿瘤中有着较高的表达[10]。由于大多数的异常增生结节中都高度表达此种酶，因此在实验中被广泛用作肝癌前病变的标志物。GST-Pi 阳性灶数目和面积在一定程度上反应了癌细胞的增殖情况[11]。本研究中抗纤抑癌方干预组GST-Pi阳性灶数量及阳性表达面积明显减少，表明抗纤抑癌方对肝细胞的异常增殖有抑制作用。

PI3K/Akt 信号通路在促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等肿瘤形成过程中发挥重要作用[12]，该通路抑制剂可显著控制肿瘤血管生成和肿瘤细胞迁移[12, 13]。此外，PI3K/Akt的激活在肝纤维化、肝硬化及肝癌的行程中发挥重要作用，诸多研究将PI3K/Akt 信号通路作为治疗慢性肝病的重要靶标。Wei等[14]研究发现，积雪草酸通过调节PI3K/Akt /mTOR信号传导途径可抑制肝星状细胞活化和细胞外基质合成，延缓CCL4 诱导的大鼠纤维化的形成。Ye等[15]通过体内及体外实验证实，鸦胆子素可抑制HCC增殖并诱导HCC凋亡，其机制与调控PI3K/Akt /mTOR信号通路相关。本研究显示抗纤抑癌方可下调PI3K/Akt通路中相关mRNA及蛋白的表达，抑制PI3K及Akt的磷酸化，从而诱导异型细胞凋亡，进一步阻断肝癌前病变的进展。

综上所述，抗纤抑癌方对于大鼠的肝癌前病变具有抑制作用，其机制可能与调控PI3K /Akt 信号通路相关。本研究结果为抗纤抑癌方干预肝癌前病变作用机制的深入探讨提供了一定的实验依据。