抗病毒治疗对慢性乙型肝炎患者外周血HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞的影响及其临床意义*

黄金华 崔显念 姜 宜 黄 敏 余 冰

1.恩施州中心医院中医部检验科(湖北 恩施， 445000) 2.华中科技大学同济医学院基础医学院

慢性乙型肝炎(CHB)感染属于传染科常见疾病，临床主要表现为全身乏力、腹胀、肝区疼痛及恶心等，若未及时发现并采取有效治疗，随着疾病进展，患者可能出现慢性肝病面容、肝功能异常及脾大等现象，严重者甚至转变为肝癌或者肝硬化，直接威胁其生命安全，降低生活质量，因此临床尽早诊断、准确评估预后成为关键[1～4]。因此笔者展开研究，探讨CHB患者抗病毒治疗前后外周血HBV特异性CTL变化及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择我院2016年7月至2018年1月收治的90例慢性HBV感染患者作为A组，51例非病毒性肝病患者作为B组，另选择同一时间体检的80例健康者作为C组。A组男47例，女43例，年龄32～58岁，平均年龄(43.58±1.25)岁，均符合《病毒性肝炎防治方案》中CHB的诊断标准[5]。B组男28例，女23例，年龄33～58岁，平均年龄(43.17±1.19)岁。C组男41例，女39例，年龄33～58岁，平均年龄(43.27±1.20)岁。3组人员一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 治疗方式：给予A组患者抗病毒治疗。全面了解具体病情，选择合适的药物进行治疗，药物包括干扰素、阿德福韦、拉米夫定、恩替卡韦、替比夫定等。

1.2.2 HLA-A2等位型：清晨收集所有患者空腹静脉血(100μl)，采取肝素钠进行抗凝，经溶血、洗涤、固定后分别在检测试管及对照试管中添加抗人HLA-A2单克隆抗体及对照品(10μl)，置于16～27℃下避光孵育30min，利用流式细胞仪进行检测，若HLA-A2+表达率超出90%为阳性[6]。

1.2.3 HBV特异性CTL：将CD8+五聚体+T淋巴细胞作为HBV特异性CTL,其阳性率=五聚体+CD8+/CD8+×100.00%[7]。每例患者均设置CD8-五聚体-、五聚体-CD8+与五聚体-CD8+细胞对照，均放入肝素钠抗凝全血(100μl)，添加MHC-五聚体(1μl)、抗CD8单克隆抗体(10μl)及对照品，摇晃均匀，避光冰浴30min。放入2ml 1×FACS裂解液，室温下存放10min，PBS液洗涤，1%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。

1.2.4 HBV DNA检测：煮沸法提取血清DNA，收集50μl复融后血清标本，放入浓缩液50μl，13000r/min离心10min，取上层血清，加入裂解液50μl，摇晃均匀后置于100℃金属浴中10min，13000r/min离心10min，取上层清液作为PCR模板。常规套式PCR扩增，其产物采取30g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，存在513bp条带判定为阳性。

1.2.5 ALT检测：清晨收集所有患者空腹静脉血，分离血清，采取7150生化分析仪器及配套试剂进行检测，参考范围为5～40U/L[8]。

2 结果

2.1 3组人员HLA-A2等位型检测结果 见表1。

2.2 3组人员HBV特异性CTL检测结果见表2。

表1 HLA-A2等位型检测结果 [n(%)]

与A组治疗前比较，*P<0.05；与A组治疗后比较，#P<0.05

表2 HBV特异性CTL检测结果(%)

与A组治疗前比较，*P<0.05；与A组治疗后比较，较#P<0.05；与HLA-A2+比较，&P<0.05

2.3 3组人员HBV DNA及ALT检测结果 见表3。

3 讨论

我国是CHB高发国家之一，多数患者病程较长，随着疾病发展，可能并发其他疾病，加重健康负担，给患者带来沉重的心理负担，降低生活质量，严重者甚至转变成为肝硬化或者肝癌，直接危及生命[9～11]。

相关报道中曾指出[12]，机体中是否能够出现针对HBV表面蛋白的辅助性T细胞、CD8+T淋巴细胞反应是稳定HBV感染的关键。但CTL活化与生物学效应均受到HLA-I的影响，具有一定局限性，因此不同HLA-1等位型可能存在不同的抗原表位，若能够针对HLA-A2等位型进行有效判断，可为HBV特异CTL水平的体现提供保障[13，14]。本研究提示A组患者治疗前后HLA-A2阳性率存在较大差异，与B、C组相比也存在一定差异，说明该指标能够成为判断疾病、评估治疗效果的主要指标，为治疗方案的更换及预后提供保障。既往报道显示[15]，细胞免疫在HBV感染中具有重要意义。其中CTL能够分泌各种细胞因子参与免疫作用，并有效杀灭病毒，作为主要的效应细胞与其病毒清除及肝细胞受损存在密切相关性。本研究结果中A组HLA-A2+患者的特异性CTL阳性率较HLA-A2-者低，说明HLA-A2在HBV特异性CTL中具有一定抑制效果。而HBV DNA、ALT属于肝脏损伤的主要标志物，A组经过治疗后HBV特异性CTL阳性率明显升高，HBV DNA、ALT水平有所减少，说明及时采取有效治疗可降低对肝脏的损害，同时控制病毒传染。

表3 3组人员HBV DNA及ALT检测结果

与A组治疗前比较，*P<0.05；与A组治疗后比较，#P<0.05；与同组HLA-A2+比较，&P<0.05

综上所述，外周血HBV特异性CTL在CHB中具有重要作用，可以作为判断病情、疗效评估及预后评估指标。