云南重楼UPLC特征图谱研究

文/高妍 李德旺 过立农 马双成 刘杰 郑健 昝珂

重楼为传统中药中常用的大宗药材，在傣族、蒙古族、苗族、藏族等多个民族中具有悠久的药用历史，是云南白药、宫血宁、重楼解毒酊等81 种中成药的主要原料[1，2]。其味苦、微寒，有清热解毒、消肿止血、凉肝定惊等功效。现代药理学研究表明，重楼在抗肿瘤、抑菌消炎、抗病毒、止血、止痛镇静、免疫调节等方面具有很好的活性[3-7]。重楼药材及饮片为《中国药典》2015年版一部收载品种，为百合科植物云南重楼Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或 七叶一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根茎[2]。依据拉丁名检索，七叶一枝花对应于《中国植物志》1978年版的中华重楼。云南重楼的化学成分有甾体皂苷类、甾醇、蜕皮激素、黄酮类等。其中甾体皂苷研究较多，并认为是重楼中最主要的活性物质[8-12]。

有文献报道，重楼属植物全世界有24 种，中国有19 种，各品种在原植物特征和药材性状上具有相似性，仅依据根茎鉴定难度较大。已有研究发现[13，14]，重楼的生长环境遭到破坏，植物繁殖率低，资源再生较慢，各产区药材蕴藏量普遍下降。目前，在云南、四川等地已有规模较大的人工栽培基地[15-17]。前期研究发现市场上重楼饮片多为云南重楼，且存在混伪品，例如以吉林延龄草充重楼饮片销售的现象。因此，需要建立一种可以有效鉴别云南重楼的分析方法，以控制重楼药材及饮片的质量。

基于本课题组的前期研究基础[8]，本研究通过收集云南重楼、华重楼及伪品饮片样品，采用UPLC 法建立了云南重楼特征图谱。同时，计算云南重楼、华重楼和伪品的相似度，并开展聚类分析和主成分分析。本方法可以为重楼药材和饮片的鉴别和安全用药提供科学依据。

1.仪器与材料

1.1 仪器

Waters ACQUITY UPLC型高效液相色谱仪（包括自动进样器，DAD 检测器，柱温箱，工作站）；ELMA P120H 型超声波清洗器（德国ELMA 公司）；默克Milli-Q 纯水系统；Mettler XS 105 Du 十万分之一天平（德国梅特勒公司）；Mettler AE240万分之一天平（德国梅特勒公司）。

1.2 材料

药材：云南重楼（编号为1～10），华重楼（编号为11～13），伪品（编号为14～20），样品经中国食品药品检定研究院郑健研究员鉴定，样品信息见表1。

试药：伪原纤细薯蓣皂苷（批号：Y19F7H9835， 纯度98%）、重楼皂 苷H（ 批号：Y21A9H68360， 纯度98%）、纤细薯蓣皂苷（批号：CF0227QC14，纯度98%）和重楼皂苷Ⅴ（批号：Y19F7H9835，纯度98%）由上海源叶生物科技有限公司提供；重楼皂苷Ⅶ（批号：111593-201604， 纯度94%）、重楼皂苷Ⅵ（批号：111592-201604， 纯 度98%）、重楼皂苷Ⅱ（批号：111591-201604，纯度96.1%）、薯蓣皂苷（批号：111707-201703，纯度91.4%）、重楼皂苷Ⅰ（批号：111590-201604，纯度93.6%）由中国食品药品检定研究院提供。

试剂：甲醇（色谱纯，Lot.152023，Fisher公司）和乙腈（色谱纯，Lot.150942，Fisher 公司），水为默克Milli-Q制超纯水。

2.方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液

分别精密称取伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅵ、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ对照品适量于1 ml 量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得各对照品储备液。分别取各对照品储备液适量于量瓶中，甲醇定容至刻度，即得对照品单标溶液。

表1 云南重楼、华重楼、伪品样品信息

2.1.2 供试品溶液

本品粉末（过三号筛）约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流30 分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 色谱条件与系统适应性试验

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm）；以乙腈为流动相A、水溶液为流动相B 进行梯度洗脱（表2）；流速0.3 ml/min，进样量10μl，柱温40℃，检测波长203 nm，记录35 分钟的色谱图。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

按照“2.2”项下的色谱条件，精密吸取同一供试品溶液（编号：2）连续进样6 次，每次10 μl，所得特征峰的相对保留时间的RSD 均＜0.78%，特征峰的相对峰面积RSD 均＜2.28% （n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（编号2），于配制后的0、4、8、12、16、24 小时进样，所有特征峰的相对保留时间的RSD 均＜1.13%、相对峰面积的RSD均＜2.56%（n=6），表明供试品溶液在配制后24 小时内稳定。

2.3.3 重复性试验

取同一批号（编号：2）样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，依法测定，所得特征峰的相对保留时间的RSD 均＜0.96%，特征峰的相对峰面积 的RSD 均＜2.87%（n=6），结果表明本方法重复性较好。

2.4 特征图谱

2.4.1 云南重楼特征图谱的建立

取10 批云南重楼样品（样品1 ～10）粉末，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μl，分别进样测定，记录35 分钟的UPLC 色谱图（ 图1）。 采用ChemPattern 化学计量学软件（北京科迈恩科技有限公司）对实验室数据进行分析处理，设定样品1、3、7、10 为代表性图谱生成共有模式图，将其他样品的色谱峰与共有模式图进行自动匹配，生成云南重楼的特征图谱（图2），计算样品1 ～10 与特征图谱的相似度，分别为0.72、0.83、0.74、0.75、0.73、0.72、0.74、0.70、0.70、0.83，各批云南重楼正品之间的相似度均大于0.70，说明相似度良好。

表2 梯度洗脱程序

2.4.2 特征峰的标定

根据10 批云南重楼的特征图谱检测结果，共标定8 个特征峰，如图2所示。经过与对照品比对，并结合DAD 光谱，可知1 号峰为伪原纤细薯蓣皂苷、2号峰为重楼皂苷Ⅶ、3 号峰为重楼皂苷H、4 号峰为重楼皂苷Ⅱ、5 号峰为薯蓣皂苷、6 号峰为纤细薯蓣皂苷、7 号峰为重楼皂苷Ⅰ、8 号峰为重楼皂苷Ⅴ。

2.4.3 华重楼与云南重楼特征图谱比较

图1 10 批云南重楼UPLC 叠加图

图2 云南重楼UPLC 特征图谱

图3 3 批华重楼UPLC 叠加图

取不同批次的华重楼（样品11～13）粉末，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录35 分钟的UPLC 色谱图（图3），图中主要包含3 个峰，其中1 号峰为重楼皂苷Ⅶ。华重楼与云南重楼特征图谱的主要区别为：云南重楼中具有较高含量的薯蓣皂苷类成分，如重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷和重楼皂苷Ⅰ，而华重楼几乎不含上述成分。 采 用ChemPattern 化 学计量学软件对实验数据进行分析处理，计算样品11～13 华重楼与特征图谱的相似度，分别为0.32、0.26、0.37，可见华重楼和云南重楼特征图谱差异大，存在显著不同。

2.4.4 伪品与云南重楼特征图谱比较

取不同批次的伪品（样品14～20）粉末，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样测定，记录35 min的UPLC 色谱图（图4），图中主要包含3 个峰，其中1 号峰为重楼皂苷Ⅶ，3 号峰为重楼皂苷Ⅵ。本实验中收集到的伪品与云南重楼特征图谱的主要区别为：云南重楼同时含有重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷和重楼皂苷Ⅰ，而伪品几乎不含上述成分。同时，重楼皂苷Ⅵ为伪品的主要成分，云南重楼和华重楼中几乎不含该成分。采用ChemPattern化学计量学软件对实验数据进行分析处理，计算样品14～20 伪品与特征图谱的相似度，分别为0.18、0.22、0.22、0.19、0.15、0.17、0.20，可见伪品和正品特征图谱差异大，存在显著不同，可用于重楼的鉴别和质量控制。

图4 7 批伪品UPLC 叠加图

图5 云南重楼、华重楼及伪品相似度分析

云南重楼、华重楼和伪品相似度分析见图5。

2.4.5 化学计量学分析

将色谱仪采集的数据以＊.cdf格式导出，再导入ChemPattern化学计量学软件，对相应的色谱峰进行积分，按样品对峰面积进行标准化处理，再进行聚类分析（图6）和主成分分析（图7）。如图6和图7所示，建立的特征图谱方法采用聚类分析和主成分分析均能够将云南重楼和其他样品（华重楼、伪品）分成2 组，进一步，华重楼与伪品分为2 组，从而达到鉴别的目的。

3.讨论

3.1 色谱条件的选择

图6 云南重楼、华重楼及伪品聚类分析结果

图7 云南重楼、华重楼及伪品主成分分析结果

本文选用UPLC 梯度洗脱法建立了云南重楼的特征图谱，获得了云南重楼化学成分的整体情况，35 分钟内完成分离。其主要成分伪原纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅶ、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅱ、薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅴ的分离效果良好。通过二极管阵列检测器考察最适紫外吸收波长时，综合考虑8 个主要成分的最大吸收，最终选择203 nm 为检测波长。

3.2 特征图谱

10 批云南重楼UPLC 图谱与特征图谱之间的相似度均大于0.70，相似度良好，表明各批次云南重楼的化学成分种类、比例相似，而3 批华重楼与特征图谱之间相似度为0.26～0.37，说明《中国药典》规定的重楼两个正品品种云南重楼和华重楼化学成分存在差异；7 批伪品UPLC 图谱与特征图谱之间相似度均小于0.22，相似度较低，与正品化学成分差异较大。由聚类分析和主成分分析结果可知，两种分析方式均能够将云南重楼、华重楼和伪品区分开来。由此可见，本文建立的特征图谱可以有效区分云南重楼、华重楼和伪品，可以为控制重楼质量提供依据。

《中国药典》2015 版一部以重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅷ为指标成分对重楼药材进行质量控制，不能达到区分市场上云南重楼、华重楼和伪品的目的，尤其是以重楼投料生产的中成药中，若掺入伪品，中成药质量将难以控制。本实验建立了云南重楼的特征图谱以区分云南重楼、华重楼和伪品，为有效控制重楼质量提供了科学依据。