利拉鲁肽改善糖尿病心肌病大鼠心脏脂质异位沉积的效果和机制研究

蔡欢，何玉秀，刘静芹，冯然，刘涛，李勋

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）是继发于糖尿病的一种独立于冠心病和高血压的心肌病，其病理机制目前仍不明确。选择有心血管保护作用的降糖药物是临床研究的迫切任务。LEADER 研究表明，胰高血糖素样肽（glucagon-like peptide-1，GLP-1）类似物利拉鲁肽除了显著降低血糖和血脂外，还具有心血管保护作用，主要通过降低内质网应激、降低氧化应激水平和心肌细胞自噬发挥心脏保护作用[1-3]，但目前少有研究评估该药物对糖尿病心肌脂代谢紊乱的改善效果。本研究旨在观察利拉鲁肽对DCM 大鼠心肌脂质异位沉积的改善作用，并探索潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及糖尿病心肌病大鼠模型的建立和分组干预

选 取8 周 龄 雄 性Wistar 大 鼠60 只，体 重180～220 g，清洁级，购于河北医科大学动物实验中心。随机选取8 只大鼠作为对照组，普通饲料饲养；其余52 只大鼠给予高糖高脂饮食饲养，4 周后空腹状态下一次性腹腔注射链脲佐菌素（35 mg/kg，溶于pH 4.5 的0.1 mol/L 的柠檬酸盐缓冲液）制作糖尿病模型[3]，对照组大鼠腹腔注射同体积的柠檬酸缓冲液。72 小时后测空腹血糖（FBG），1 周后复测，两次均≥11.1 mmol/L 认为糖尿病造模成功，然后继续饲以高糖高脂饮食，连续6 周后，经超声心动图检查选出符合DCM 模型[4]的大鼠，共 24只，随机分为DCM 组、低剂量利拉鲁肽治疗组（LL组）、高剂量利拉鲁肽治疗组（HL 组），每组各8 只。LL 组和HL 组分别给予利拉鲁肽0.2 mg/（kg·d）和0.4 mg/（kg·d）皮下注射，对照组和DCM 组给予等体积的生理盐水皮下注射，每日1 次，共干预8 周。随后经超声心动图检查心功能后麻醉处死大鼠。干预期间，对照组给予普通饲料，其余三组给予高糖高脂饲料，自由饮水，直至实验结束。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠生化指标检测

干预8 周后，各组大鼠禁食12 h，1%戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，心脏采血，分离血清，-20℃保存。检测各组大鼠的FBG、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和血清空腹胰岛素（FINS）水平。计算胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）和胰岛β 细胞功能指数（HOMA-β）：HOMA-IR=FBG（mmol/L）× FINS（mIU/L）/22.5；HOMA-β=20× FINS（mIU/L）/[FBG（mmol/L）-3.5]。

1.2.2 大鼠心脏功能检测

干预8 周后，用1%戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，固定后用彩色多普勒超声（Fujifilm，加拿大）进行超声心动图检查。经乳头肌切面扫描左心室短轴切面，记录M 超图线，测量左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短分数（LVFS）、每搏输出量（SV）等指标；由心尖部左心室长轴切面记录二尖瓣血流频谱，测左心室舒张早期最大血流/二尖瓣心房收缩期最大血流比值（E/A）以及等容舒张时间（IVRT）。所有测量数值通过3 个连续心动周期的平均值获取。

1.2.3 大鼠心肌组织游离脂肪酸和二酰甘油含量测定

干预8 周后，各组大鼠取心尖部位组织50 mg左右，制作10%匀浆，4℃条件下3500 转/min 离心15 min，吸取上清液，比色法测定游离脂肪酸（FFA）和二酰甘油（DAG）的含量。

1.2.4 标本处理及电镜标本制备

各组大鼠处死后，迅速取出心脏，用冰盐水冲洗干净，滤纸吸干水分后称重并计算心脏重量指数[心脏重量（mg）/体重（g）]。取5 mm 左右心肌组织，石蜡包埋，进行苏木素伊红（HE）染色。左心室中部取1 mm3组织，放入2.5%戊二醛中制备透射电镜标本。其余部分放入冻存管中-80℃冰箱保存。

1.2.5 荧光定量PCR 检测

对大鼠心肌组织腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）、B 型利钠肽（BNP）、白细胞分化抗原36（CD36）、叉头框转录因子1（FOXO1）、过氧化物酶增殖物激活受体α（PPARα）等脂代谢相关基因进行荧光定量PCR 检测。提取心肌组织总RNA，测定RNA 浓度。用First Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（Thermo,美国）进行逆转录反应，操作方法按照试剂盒说明书进行。之后采用SYBR Green 荧光法（Roche,瑞士）进行实时荧光定量PCR 反应。用于PCR 扩增的引物序列见表1。结果通过相关基因表达/内参β微管蛋白（β-tublin）表达的相对量来表现。

表1 逆转录PCR 扩增的特异性引物序列表

1.2.6 蛋白免疫印迹法检测

30 mg 心肌组织提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。每孔加入20 μg 蛋白进行SDS-PAGE 电泳，加入一 抗、CD36（1:1 000，Abcam）、AMPK（1:1 000，Abcam）、FOXO1（1:1000，Proteintech）、磷 酸 化AMPK（p-AMPK，1:1 000，Abcam）、磷酸化FOXO1（p-FOXO1，1:1 000，Abcam）、β-tublin（1:1 000，Santa），4℃过夜；之后加入1:3 000 稀释的二抗，室温孵育2 h，化学发光法（ECL）显示。采用Image J软件对结果进行图像分析，β-tublin 作为内参，比较各组条带的光密度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行统计学分析，通过ShaPiro Wilk 进行正态分布检验，正态计量资料以均数±标准差（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，用Bonferroni 校正。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清生化指标比较（表2）

干预8 周后，与对照组比较，DCM 组大鼠FBG、FINS、HOMA-IR、TG 和LDL-C 水平显著升高，HOMA-β 显著降低（P均＜0.05），TC、HDL-C水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与DCM 组相比，LL 组和HL 组大鼠FBG、HOMA-IR、TG、LDL-C水平显著降低，FINS、HOMA-β 显著升高（P均＜0.05），HL 组大鼠HDL-C 水平明显升高（P＜0.05），3 组大鼠TC 水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）；与LL 组相比，HL 组大鼠HOMA-β、HDL-C 水平显著升高（P均＜0.05），其余指标差异无统计学意义（P均＞0.05）。

2.2 各组大鼠心功能和心脏重量指数比较（表3）

干预8 周后，与对照组相比，DCM 组大鼠心脏重量指数明显增加（P＜0.01），LL 组和HL 组大鼠心脏重量指数均显著降低（P均＜0.01），HL 组比LL 组降低更明显（P＜0.05）。超声心动图检查结果显示，与对照组相比，DCM 组大鼠LVEF、LVFS 和SV 均显著降低，E/A 比值明显升高，IVRT 显著延长（P均＜0.05）；与DCM 组相比，LL 组和HL 组大鼠E/A 比值均明显降低（恢复到正常范围），LVEF 均显著增加（P均＜0.01），LVFS、SV 和IVRT 差异均无统计学意义（P均＞0.05）；LL 组与HL 组大鼠在E/A 比值、LVEF、LVFS、SV、IVRT 等方面的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

表2 各组大鼠血清生化指标比较（n=8，）

表2 各组大鼠血清生化指标比较（n=8，）

注：DCM 组：糖尿病心肌病组；LL 组：低剂量利拉鲁肽治疗组；HL 组：高剂量利拉鲁肽治疗组。FBG：空腹血糖；FINS：空腹胰岛素；HOMAIR：胰岛素抵抗指数；HOMA-β：胰岛β 细胞功能指数；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇。与对照组比较* P＜0.05**P＜0.01；与DCM 组比较△P＜0.05△△P＜0.01；与LL 组比较▲P＜0.05▲▲P＜0.01

表3 各组大鼠心功能及心脏重量指数比较（n=8，）

表3 各组大鼠心功能及心脏重量指数比较（n=8，）

注：DCM 组：糖尿病心肌病组；LL 组：低剂量利拉鲁肽治疗组；HL 组：高剂量利拉鲁肽治疗组。E/A：左心室舒张早期最大血流/二尖瓣心房收缩期最大血流比值；IVRT：等容舒张时间；LVEF：左心室射血分数；LVFS：左心室短轴缩短分数；SV：每搏输出量。与对照组比较*P＜0.05**P＜0.01；与DCM 组比较△△P＜0.01；与LL 组比较▲P＜0.05

2.3 各组大鼠心肌组织形态及超微结构比较（图1）

HE 染色后光镜下观察各组大鼠心肌组织形态可见：对照组大鼠心肌细胞排列整齐、致密，心肌纤维间链接紧密，染色均匀，未见肌纤维溶解；DCM 组大鼠心肌有较明显的心肌纤维损伤和断裂，心肌纤维排列紊乱，肌纤维间隙明显增宽，组织间隙有血细胞堆积；经利拉鲁肽干预后，LL 组和HL组大鼠心肌纤维排列较整齐，无断裂、紊乱，心肌充血减少，细胞形态大体完整，HL 组效果明显优于LL 组。

透射电镜下观察各组大鼠心肌细胞超微结构可见：DCM 组大鼠心肌细胞超微结构紊乱，肌丝溶解，排列紊乱，间质胶原纤维增多，大量脂滴堆积于线粒体旁和肌丝之间，心肌间有大量溶解空泡，线粒体数量减少，正常形态结构改变，线粒体嵴减少；与DCM 组比较，LL 组和HL 组大鼠心脏肌丝排列整齐，可见明显Z 线，线粒体数量增加，体积增大，脂滴堆积明显减少。

图1 各组大鼠左心室心肌组织形态及超微结构比较

2.4 各组大鼠心肌游离脂肪酸和二酰甘油水平比较

干 预8 周 后，DCM 组 大 鼠 心 肌 内FFA[（72.21±18.11）μmol/L vs（51.40±11.14）μmol/L]和DAG[（0.62±0.18）ng/ml vs（0.39±0.10）ng/ml]水平与对照组相比均显著升高（P均＜0.01）；与DCM组相比，LL 组与HL 组大鼠心肌内FFA[两组分别为（48.60±7.27）μmol/L 和（47.71±10.67）μmol/L]和DAG[两组分别为（0.38±0.07）ng/ml 和（0.37±0.10）ng/ml]水平均显著降低（P均＜0.01），但LL 组与HL组比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.5 各组大鼠心肌组织中过氧化物酶增殖物激活受体α 和B 型利钠肽mRNA 表达水平比较

干预8 周后，荧光定量PCR 检测结果显示，DCM 组大鼠心肌组织中PPARα 和BNP 的 mRNA表达水平显著高于对照组（相对表达水平分别为8.40±1.76 和12.37±3.02，P均＜0.01），LL 组与HL 组大鼠心肌PPARα（相对表达水平分别为1.27±0.37 和2.81±0.36）和BNP（相对表达水平分别为2.50±0.54 和2.17±0.99）的 mRNA 表达水平均显著降低（P均＜0.01），但LL 组与HL 组之间差异均无统计学意义（P均＞0.05）。

2.6 各组大鼠心肌组织中腺苷单磷酸活化蛋白激酶、叉头框转录因子1、白细胞分化抗原36 mRNA 和蛋白表达水平比较（图2～4）

干预8 周后，DCM 组大鼠心肌组织中AMPK 的mRNA 表达水平均略低于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；LL 组和HL 组大鼠心肌组织中AMPK 的mRNA 表达水平均高于DCM 组（三组相对表达水平分 别 为4.83±0.72、5.68±0.76 和0.77±0.09，P均＜0.01），但LL 组和HL 组间差异均无统计学意义（P均＞0.05）；各组大鼠心肌组织中AMPK 蛋白表达水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，DCM组大鼠心肌AMPK 活性（p-AMPK/AMPK 蛋白表达水平比值）受抑制，LL 组和HL 组大鼠心肌AMPK 活性较DCM 组均有不同程度升高，但LL 组和HL 组之间的差异无统计学意义（P＞0.05，图2）。

DCM 组大鼠心肌组织中FOXO1 的mRNA（相对表达水平为7.33±1.71）和蛋白水平较对照组均显著升高，LL 组和HL 组大鼠心肌组织中FOXO1的mRNA（相对表达水平分别为1.79±0.17 和1.64±0.33）和蛋白表达水平较DCM组均显著下降（P均＜0.01），但LL 组和HL 组之间差异均无统计学意义（P均＞0.05，图3）。

与对照组相比，DCM 组大鼠心肌组织中CD36的 mRNA（相对表达水平为8.22±2.76）和蛋白表达水平显著增加（P均＜0.01）。LL 组和HL 组大鼠心肌组织中CD36 的 mRNA（相对表达水平分别为3.05±0.79 和3.08±0.84）和蛋白表达水平均显著低于DCM 组（P均＜0.01），但LL 组和HL 组之间的差异均无统计学意义（P均＞0.05，图4）。

图2 各组大鼠心肌组织中AMPK 蛋白表达水平比较

图3 各组大鼠心肌组织中FOXO1 蛋白表达水平比较

图4 各组大鼠心肌组织中CD36 蛋白表达水平比较

3 讨论

糖尿病是当今社会面临的一个严重健康问题，也是心力衰竭的重要危险因素之一[5]。本研究发现DCM 早期表现为左心室舒张功能受损，DCM 大鼠心脏E/A 比值＜1、IVRT 延长，此阶段心脏出现代偿性肥厚[6]。干预8 周后，DCM 大鼠收缩功能和舒张功能同时出现异常，即E/A 比值＞1.5，LVEF 显著降低，此阶段舒张功能严重损害，心肌僵硬性增加，导致心脏充盈受限，出现扩张型心肌病的血流动力学改变[7]。同时，DCM 大鼠出现高血糖、高血脂、胰岛素抵抗、胰岛素敏感性降低等现象。因此，在DCM 的发生、发展过程中，控制血糖、血脂具有重要意义。

利拉鲁肽是一种肠促激素[8]，通过刺激血糖水平依赖的胰岛素分泌、拟胰岛素作用以及抑制胰高血糖素的分泌，从而达到降糖效果[9]。相比于其他降糖药物，利拉鲁肽可以提高LVEF，提高心肌梗死后的存活率，具有心脏保护作用[10]。本研究应用利拉鲁肽治疗8 周后，LL 组和HL 组大鼠的高血糖、高血脂和胰岛素抵抗均显著改善，心功能得到提高。这与Kraljevic 等[11]的研究结果部分一致。本研究还发现，HL 组比LL 组大鼠的HDL-C 水平改善更显著，说明较高剂量利拉鲁肽的调脂作用更佳。

心肌脂质异位沉积是DCM 的一个标志性指标，标志着DCM 进入比较严重的阶段。在该阶段，心肌细胞周围堆积大量脂滴，心脏重量增加，僵硬性增加，进而影响心室的收缩功能[12]。本研究表明，DCM 大鼠心脏重量指数增加，HE 染色光镜和透射电镜检查结果显示，DCM 大鼠心肌纤维断裂，心肌纤维周围出现大量脂滴堆积，说明糖尿病大鼠心室出现以脂质异位堆积为特点的心室重构。心肌细胞内FFA 增加所造成的脂毒性使膜相关离子通道和泵功能发生改变，从而直接损害心肌的收缩功能[13]。本研究发现，DCM 组大鼠心肌内FFA 和DAG 水平明显高于对照组大鼠，说明脂毒性物质在心肌内大量堆积，也直接证实了以上组织形态学的实验结果。HL 组大鼠经利拉鲁肽干预8 周后，心脏重量指数降低，心脏超微结构显著恢复，这与Liu 等[14]的研究结果一致，高剂量利拉鲁肽对心肌形态的改善效果优于低剂量利拉鲁肽。两种剂量的利拉鲁肽均可降低DCM 大鼠心肌内脂质异位堆积，减轻脂毒性。

本研究还显示，DCM 大鼠心肌内PPARα 和BNP 的mRNA 水平升高，说明DCM 大鼠心肌出现脂代谢紊乱以及有心力衰竭的表现。PPARα 与DCM 糖脂代谢紊乱有密切联系，PPARα 通过上调FFA 转运相关蛋白和脂质合成相关酶的表达，增加心肌对FFA 的摄取，促进心肌内脂质堆积[15]。FFA作为PPARα 的配体，可激活PPARα。本研究中，利拉鲁肽显著降低DCM 大鼠心肌组织中FFA 水平，从而抑制了PPARα 的激活，缓解了DCM 大鼠心肌脂代谢紊乱。BNP 是心力衰竭的重要指标，糖尿病与BNP 正相关[16]。本研究显示，利拉鲁肽可显著下调DCM 大鼠心肌BNP mRNA 的表达水平，逆转心衰进程，这与此前的临床研究结果一致[17]。

DCM 有多种发病机制，糖脂代谢紊乱是基础，长期高血糖和胰岛素抵抗直接导致心肌细胞能量代谢紊乱。AMPK 是细胞内的能量感受器，可以在缺氧、葡萄糖缺乏等情况下激活，之后磷酸化其下游蛋白，改变细胞能量代谢[18]。AMPK 可以调节很多蛋白，FOXO1 是AMPK 重要的下游分子，参与多种细胞生物学的信号转导及调控。有研究指出，FOXO1 的慢性激活是导致DCM 的原因之一[19]。当心肌细胞特异性抑制FOXO1 的活性时，高脂饮食诱导的心肌肥厚以及心功能降低和胰岛素敏感性下降等现象可得到逆转[20]。心肌细胞敲除FOXO1 后，心肌代谢从以FFA 代谢为主转变为以葡萄糖代谢为主，心肌内脂质堆积减少[21]。当处于糖尿病或肥胖状态时，心肌内脂质增多会加强FOXO1 的核聚集以及CD36从胞质中转运到细胞膜上，增强心肌对FFA 的摄取，加剧心肌内脂质堆积[22]。本研究通过将DCM 大鼠与正常大鼠比较，发现FOXO1 活性在DCM 大鼠心肌内显著升高，同时AMPK 活性受到抑制；经利拉鲁肽干预8 周后，大鼠心肌组织中AMPK 活性显著提高，FOXO1 活性降低，CD36 向细胞膜移位减少，减少心肌细胞对脂肪酸的摄取，降低心肌内脂质堆积。

综上，DCM 导致心肌内AMPK 活性下降，从而上调FOXO1 的表达，FOXO1 促使脂肪酸转运载体CD36 表达增加，使长链脂肪酸摄取增加，引起细胞凋亡，从而导致心脏功能的损害。利拉鲁肽一方面通过作用于胰岛细胞上的GLP-1 受体，通过环磷酸腺苷（cAMP）信号通路刺激胰岛素分泌，降低血糖、血脂和胰岛素抵抗，减少循环中脂肪酸含量，从而减少心肌细胞对脂肪酸的摄取；另一方面直接作用于心肌脂代谢相关因子，通过激活AMPKFOXO1-CD36 信号通路改善DCM 大鼠心肌脂质异位沉积，从而改善左心室收缩舒张功能，发挥心脏保护作用。本研究中，高、低剂量利拉鲁肽干预对DCM 大鼠的心脏保护作用没有显著差异，需进一步探讨其原因。