完全性肺静脉异位引流基因学研究进展

王静、石鑫、陈笋、孙锟综述，于昱审校

完全性肺静脉异位引流（total anomalous pulmonary venous connecting，TAPVC）是一种罕见的先天性心脏病（先心病），指全部肺静脉未与左心房相连，而与体循环静脉或右心房相连。其发生率约0.6～1.2/10 000 例新生儿，约占先心病发病率的0.7～1.5%[1]。Neill 等1960 年首次在弯刀综合征中描述了 TAPVC。发病的患儿多以青紫、心脏杂音等临床表现首次就诊，常伴呼吸道感染、喂养困难、充血性心力衰竭等临床症状[2]。尽管彩色超声多普勒检查可以确诊，其仍然是产前诊断中容易漏诊的心脏病[3]。TAPVC 患者在婴幼儿甚至新生儿期出现严重的症状，需要早期手术治疗，手术以恢复肺静脉与心房连接的解剖位置为主[4]。患儿1 岁前如果没有手术干预，死亡率达到48.8%[5]。因此，TAPVC严重危害婴幼儿健康，给家庭和社会造成了沉重的精神及经济负担。以下将分别从肺静脉胚胎发育角度和基因角度对TAPVC 的病因进行阐述，为TAPVC 的预防、治疗提供理论指导。

1 肺静脉胚胎发育中TAPVC 的形成过程

肺静脉的发育是一个复杂的过程，发生在胚胎早期，通过对人和动物的胚胎学研究，一个广为接受的学说认为：肺芽起自前肠，汇入内脏静脉丛。血循环开始于肺芽，妊娠34 天即有血液循环通过肺芽，收集成对的主静脉血和脐卵黄静脉血后终止于内脏静脉丛。右侧的主静脉系统最终发育为右上腔静脉（superior vena cava，SVC），而左侧的主静脉系统大多退化，仅有不到1%的人存在左上腔静脉；脐卵黄静脉发育为下腔静脉（inferior vena cava，IVC）、门静脉系统和静脉导管。

随着肺的发育，肺静脉回流通过内脏静脉丛与卵黄-脐静脉的连接，将血从肺引流出与共同肺静脉（common pulmonary vein，CPV）相通，共同肺静脉汇入左心房的背侧，最终发育成4 条分开的肺静脉。肺静脉发育的最后阶段是肺芽与内脏静脉丛连接的闭锁。如果共同的肺静脉与左心房连接完全闭锁，那么4 条肺静脉全部与体循环连接，即形成完全型肺静脉异位连接；如果仅部分肺静脉与左心房连接闭锁，而与体循环连接，则形成部分型肺静脉异位连接。但是，TAPVC 形成的具体生理过程目前尚不明确，除了胚胎时期肺静脉发育异常外，从遗传学角度出发，基因是否在TAPVC 发病中扮演一定的角色呢？

2 TAPVC 形成的基因研究

人类TAPVC 家系遗传学研究表明，TAPVC 为常染色体显性遗传，具有不完全外显率及可变表达特性。近年来研究证实大量的候选基因与TAPVC 的发病关系密切。本综述仅选取几个基因作具体的概括总结，详情见表1。

2.1 血管内皮生长因子受体2（KDR）和血小板起源的生长因子受体（PDGFRA）

Bleyl 等之前提出一种观念：从基因学角度来说，TAPVC 发病与某个区域碱基的缺失或者重复有关，该区域被称为TAPVR-1 基因区间，该区间定位于4q12。TAPVR-1 区间大概有30 个基因，包括几个已知与心血管发育相关的基因，如血管内皮生长因子受体2（kinase insert domain receptor，KDR or vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）。KDR，在血管生成、血管发育、血管通透性和胚胎造血功能的调节中发挥重要作用。促进内皮细胞的增殖、存活、迁移和分化。KDR 及其小鼠同源基因在体外以高亲和力结合血管内皮生长因子，并在内皮细胞前体中表达。因而Bleyl 等[6]将KDR 作为TAPVC 发病的候选基因。之后Bleyl 等以鸡胚胎和老鼠为模型验证了PDGFRA 在肺静脉发育过程中表达异常导致的功能障碍会引起TAPVC 的发生[7]。Bleyl 等[6]用PDGFR 的阻滞剂伊马替尼处理肺静脉正处于发育阶段的鸡胚胎，发现79 只胚胎有32 只存活（32/79），存活的胚胎中有8 只出现TAPVC 的表型（8/32），即肺静脉与冠状静脉窦相连，同时伴随神经管畸形、脑出血等畸形。然而用生理盐水或生素处理作对照的鸡胚胎并没有TAPVC 表型的出现。在103 只PDGFRA 敲除的鼠胚胎（29 只全部敲除和74 只条件敲除），出现较高比率（＞30%）的流入道异常，包括TAPVC（＜7%）。然而在对照处理的胚胎中并没有TAPVC 出现。通过对鸡和老鼠切片做原位杂交实验发现：PDGFRA 受体和它的配体在老鼠和鸡胚胎表达部位和时段与人类肺静脉发育是相一致。总而言之，从人群样本与动物模型收集到的数据支持此种观点：PDGFRA 在正常肺静脉发育中发挥重要的作用，是TAPVC 的易感基因。

表1 TAPVC 候选基因总结

2.2 锚链重复域1（ANKRD1）

ANKRD1 在内皮细胞的激活发挥作用，是心脏特异性转录抑制物[8]。定位于10q23。Cinquetti 等[18]报道1 例10，21 染色体异位的TAPVC 患者，而10，21染色体异位影响基因ANKRD1 的正常表达。除此之外，也影响到位于10 号染色体另外两个基因的表达，即RPP30 和PCGF5。小鼠胚胎原位杂交结果显示ANKRD1 在发育阶段中的肺静脉中特异性表达，推测该基因在TAPVC 发病中可能发挥一定的作用。随后，Cinquetti 发现了第二例TAPVC 患者的淋巴母细胞细胞中ANKRD1 高表达，进一步推测ANKRD1表达量异常可能与TAPVC 的发病相关。最后在第三例散发性TAPVC 患者身上发现了ANKRD1 基因中的错义突变（p.Thr116Met）。并且体外试验证明了该位点突变增强了ANKRD1/ CARP 蛋白的稳定性及其抑制心脏特异性心房利钠因子（ANF）启动子的转录。Cinquetti 认为ANKRD1 过表达在心脏发育过程中干扰了静脉-心房形态的形成，因而将ANKRD1定义为TAPVC 致病的候选基因。

2.3 轴突向导因子3D（semaphorin 3D，SEMA3D）

SEMA3D，定位于7q21。Semaphorins 最初被确定为轴突导向分子[19]，但涉及多种生物学过程，包括心血管的形成。3 类轴突向导因子，主要通过神经毡蛋白、神经丛蛋白或两者共同受体复合物发出信号的分泌分子。SEMA3D 编码的蛋白质与斑马鱼的视网膜神经节细胞轴突和神经嵴迁移有关。之前，根据动物模型有人提出这样一个观点：TAPVC发生是因为肺静脉的前体，即中咽部内皮细胞没有在胚胎心房的背部正确位置定位。但是Degenhardt等[9]研究发现，尽管中咽部内皮细胞在心房背部正确定位，有35%（14/36）SEMA3D 敲除鼠出现TAPVC 或者PAPVC 的表型，即右心房和右心室肥大，肺静脉与冠状静脉窦相连或者与右心房直接相连，而出现异常的老鼠中大多数是TAPVC（13/14），且伴有房间隔缺损，没有发现其他心内畸形或者偏侧器官缺陷。而且在这些突变鼠胚胎，肺静脉丛和中咽部内皮细胞不能正确的吻合。对有肺静脉连接异常的患者测序发现SEMA3D 有F602L 位点突变，干扰了SEMA3D 的正常功能。Degenhardt 认为SEMA3D 是通过指引肺静脉内皮细胞的定位来调节肺静脉的发育，SEMA3D 对周围细胞有排斥作用，而SEMA3D F602L 位点突变降低了这种排斥能力。Degenhardt 等[9]提出了这样一种模型，正常情况下，SEMA3D 在心脏和肺血管之间部位表达，排斥内皮细胞在此部位形成异常连接；而SEMA3D 缺乏时，排斥的作用消失，允许内皮细胞进入此部位形成静脉异常连接。SEMA3D 信号通路的基因突变将是研究先心病和TAPVC 连接一个重要的突破点，其与TAPVC 关系有待进一步研究。

2.4 视黄醇结合蛋白5（retinol binding protein 5，RBP5）

RBP5，调节维生素A 的表达，参与视黄醇结合蛋白信号通路，该通路与肺静脉的起源[20]，即第二生心区发育有关。定位于12p13。Nash 等[10]对5 个相关的TAPVR 患者作SNP 分析，全基因组测序发现在RBP5 的某片段发现一个非同义突变的位点RBP5 E70Q。RBP5 基因预测是有害的，并且在TAPVC 人群中过表达。对斑马鱼注射与人类RBP5同源的基因RBP7a morpholino 及mRNA 进行敲降与补救试验。rbp7a 敲降的斑马鱼整体外观是正常的，但出现反向心脏循环的表型，异常右侧心脏环化占42%。共同注射morpholino RBP7a 和人类RBP5 信使RNA 作补救试验，结果发现这些RNA 过表达导致斑马鱼环化异常的现象消失，表明正确表达量的视黄酸的表达对心脏左右不对称结构正常发育是至关重要的。有研究者推测其他基因突变可能与RBP E70Q 共同导致肺静脉的异常连接，如NODAL（由视黄酸信号通路调节的基因，与心脏左右不对称模式相关）和视黄醇脱氢酶10（RDH10，与视黄酸新陈代谢有关），并且在TAPVC 患者身上得到了验证。这些证据支持视黄酸信号传导途径不同基因之间的遗传相互作用，并证实先天性心脏缺陷是多因素共同作用的观点[21]。另外，也应考虑环境因素，如饮食中维生素A 的摄入量。已经确定的是在加拿大人中维生素A 摄入不足会引起先心病[22]，而且TAPVC 发生率大幅提高。本研究中借助斑马鱼模型初步出现心脏异常表型，Nash 认为用斑马鱼进一步使用Crispr/cas9 技术敲入人类基因是研究这种多基因人类遗传疾病突变的理想模型，也是研究TAPVC发病机制很有前景的研究手段。

2.5 激活素受体酶1（activin receptor like kinase 1，ACVRL1）和δ-肌聚糖基因（sarcoglycan delta，SGCD）

ACVRL1 是TGF 超家族配体的细胞表面受体，定位于12q13，调控血管的发育。肌聚糖基因（Sarcoglycan Delta，SGCD），定位于5q33，南京儿童医院的研究人员在国内首次用全外显子测序方法对6 个TAPVC 患者和81 非TAPVC 对照患者进行测序，确认了2 个非同义突变，ACVRL1 c.C652T，p.R218W 和SGCD c.C717G，p.D239E[5]。有 报 道ACVRL1 的C652T 位点突变导致Galen 静脉动脉瘤畸形（VGAM）[23]。而ACVRL1 的T649G（p.T217G），G650A（p.W217X）[24]和G656A（p.G219H）这些位点突变与肺动脉高压有关。研究人员发现所有测序的TAPVC 患者都伴有肺动脉高压，手术之后都会恢复，因而推断ACVRL1 这些位点突变可能与TAPVC发病相关。虽然之前没有报道过SGCD 与TAPVC相关，SGCD（c.C717G，p.D239E）位点突变在一位患者身上再次检测到。在6 位测序患者中有2 位发现SGCD C717G 突变，并在1 位患者身上验证了此突变位点，而81 个对照患者并没有此突变。因此，推测SGCD C717G 位点突变有可能与TAPVC 相关。为了进一步验证ACVRL1 和SGCD 点突变的是TAPVC 致病基因，需要进一步的功能验证和样本分析。全外显子测序发现的突变位点给TAPVC 的临床诊断带来重要的价值。

2.6 其他

已有报道GATA4 结合蛋白（GATA binding protein 4，GATA4）K319E 位 点 突 变[11]、TBX20.I121F 位点突变与TAPVC 相关联[12]。文献中有关TAPVC 的候选基因的报道总结表1。

3 结语

心脏形态的形成是个复杂的过程，一系列基因参与其中，先心病的基因研究是探索心脏发育分子机制至关重要的部分。TAPVC 作为一种罕见的先心病，其发病机制尚不明确，尽管已经发现一些基因与TAPVC 相关，但是大部分基因是由人类遗传学方法筛查出来的，其是否能够真正导致TAPVC，其导致TAPVC 发生的具体机制仍需要更多的功能实验进行验证。另外，是否有其它新的基因可能阐释TAPVC 的发病机理，可以借助对发病群体进行全基因组、全外显子测序等手段进行筛查。对TAPVC发病的胚胎发育研究、分子病因学进行探索，对于TAPVC 疾病的预防、治疗具有重要的临床指导意义。