超高压激活鲜榨梨汁多酚氧化酶的酶学特性

尚海涛，宣晓婷，崔 燕，林旭东，俞静芬，凌建刚*

（宁波市农业科学研究院农产品加工研究所，宁波市农产品保鲜工程重点实验室，浙江 宁波 315040）

翠冠梨（Pyrus pyrifolia Nakai cv. Cuiguan）属砂梨系统，果个大、果心小、果肉乳白色、肉质松脆细腻、石细胞少、汁多味甜，是我国南方地区的主栽早熟品种。翠冠梨以早熟、产量高、品质优而广受生产者和消费者喜爱，又称“六月雪”，是盛夏解渴消暑的时令佳品。但翠冠梨果实常温下不耐贮藏，极易因发生病害而腐烂[1]。发展加工业可以延长产业链、效益链，实现农民多层次多渠道增收。

翠冠梨出汁率高、褐变程度轻、果汁鲜亮，具有良好的感官品质，是鲜榨梨汁的理想材料。传统加工以热加工为主，用以杀灭腐败微生物和钝化酶活力，但热加工会产生不良风味和营养损失[2]。梨汁对热极为敏感，易产生后熟味[3]。超高压（high pressure processing，HPP）非热加工技术是指在室温或温和加热条件下利用100～1 000 MPa压力处理食品，以达到杀菌、钝化酶活力和加工食品的目的[4]，而对于口感、风味和营养的影响很小[5]，有助于开发高品质产品，也因此受到极大地关注。有研究表明超高压处理果汁具有良好的杀菌效果[6]，但也有研究表明超高压处理很难完全钝化酶活力，甚至表现出激活效应[7]，加速果汁褐变，限制了超高压技术的应用。

本实验通过检测处理前后鲜榨梨汁中溶解氧质量浓度、总酚浓度以及多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）最适pH值、最适反应温度、热稳定性、米氏常数（Km），研究超高压处理对鲜榨梨汁货架期色泽的影响。超高压加速褐变机制的研究在应用科学上为控制酶促褐变提供参考依据，在理论科学上有助于探讨物理因素引起的酶促褐变机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

翠冠梨于2018年7月20日购于宁波市鄞州绿洲果业专业合作社。

邻苯二酚 上海展云化工有限公司；曲拉通X-100（Triton X-100） 国药集团化学试剂有限公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 上海麦克林生化科技有限公司；二甲基二碳酸盐（dimethyl dicarbonate，DMDC） 美国Sigma公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA） 杭州微生物试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

CC-600（R）plus原汁机 图们惠人电子有限公司；CQC2L-600全液相超高压设备 北京速原中天科技股份公司；CR-5色差计 日本柯尼卡美能达株式会社；UV1600紫外-可见分光光度计 上海赫尔普国际贸易有限公司；H1850R台式高速冷冻离心机 湖南湘仪离心机仪器有限公司；FG4溶解氧测定仪 瑞士梅特勒-托利多公司；PB-10数显pH计 德国赛多利斯公司；SDC-6低温恒温槽 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲜榨梨汁加工

翠冠梨去皮、去核、去柄后，采用原汁机榨汁，果汁经200 目尼龙纱布过滤后灌装，随机分为两组。一组采用超高压处理（HPP组）；另一组未处理作为对照（CK组）。

1.3.2 超高压处理

预实验中采用0、100、200、300、400、500、600 MPa超高压处理鲜榨梨汁5 min，结果表明压力越高，杀菌效果越明显，400～600 MPa处理梨汁菌落总数不超过100 CFU/mL，符合GB 7101—2015《食品安全国家标准 饮料》要求。货架期观察表明，300～600 MPa处理会加速梨汁褐变，压力越高，褐变越早、越明显。依据预实验结果，选取500 MPa、5 min作为超高压处理条件。

1.3.3 待测样品预处理

用于色泽测定的对照组再随机分为3 组：其中一组添加Triton X-100（最终体积分数1%）（Triton X-100组）；一组添加SDS（最终质量浓度2 g/L）（SDS组）；一组不做处理为对照组（CK组）。这3 组样品均添加200 mg/L DMDC以防止发酵对色泽的影响；虽然超高压处理可以控制样品发酵，但为了保持样品一致性，也添加相同质量浓度的DMDC。超高压处理后0 h立即测定样品pH值、总酚浓度、溶解氧质量浓度和菌落总数。4 组样品于25 ℃放置，每6 h取样测定色泽一次。用于酶学特性指标检测的样品分装于10 mL离心管中，-80 ℃超低温冰箱中冻藏，测定前先冷水浴融解。

1.3.4 指标测定

1.3.4.1 色泽的测定

色泽参照Gao Ge等的方法[8]，取15 mL样品于样品皿内，采用色差计测定。测定模式为反射测量，测定口径为30 mm，测定亮度（L*）、红度（a*）、黄度（b*）值。按公式（1）计算色差值（ΔE）。

式中：L0*、a0*、b0*为初始值；Lt*、at*、bt*为货架期t时的测定值。

1.3.4.2 菌落总数的测定

菌落总数参照GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》的方法，培养温度（36±1）℃，培养时间48 h。

1.3.4.3 总酚浓度的测定

总酚浓度采用福林-酚法[9]测定。取1 mL梨汁，加入4 mL蒸馏水，振荡混匀。12 000×g、4 ℃离心15 min，取1 mL上清液，加1 mL福林-酚试剂、3 mL质量分数20%无水碳酸钠。50 ℃保温30 min，测定765 nm波长处吸光度。以邻苯二酚为底物绘制标准曲线。

1.3.4.4 溶解氧质量浓度和pH值的测定

溶解氧质量浓度采用溶解氧仪测定。pH值采用pH计测定。

1.3.4.5 PPO最适反应pH值测定

参照Liu Fang等[10]的方法，配制0.05 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 3.5、pH 4.0、pH 4.5、pH 5.0、pH 5.5）、0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5）、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0、pH 8.5）。取3.5 mL梨汁，加3.5 mL缓冲液，振荡混匀，12 000×g、4 ℃离心15 min，上清液即为所提取的酶液。采用相应pH值的缓冲液配制50 mmol/L邻苯二酚溶液。3 mL反应体系中含1.9 mL缓冲液、1 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液和0.1 mL酶液。测定4 min内A420nm变化，以每分钟吸光度上升0.1作为一个酶活力单位（U）。PPO活力按公式（2）计算。

式中：A0为初始吸光度；A1为放置4 min后吸光度。

1.3.4.6 PPO最适反应温度的测定

采用PPO最适反应pH值的缓冲液提取酶液。离心管中加入1.9 mL缓冲液、1 mL 50 mmol/L邻苯二酚溶液，测定前先分别于5、15、25、35、45、55、65、75、85、95 ℃恒温槽中放置10 min，然后加入0.1 mL酶液，立即计时再放置4 min，然后测定A420nm。以沸水浴5 min钝化酶活力的酶液作为空白。PPO活力按公式（2）计算。

1.3.4.7 PPO热稳定性的测定

采用PPO最适反应pH值的缓冲液提取酶液。然后将酶液置于45、55、65、75、85、95 ℃恒温槽中，分别水浴10、20、30、40、50、60 min。水浴后用冰水降温，PPO活力按公式（2）计算。

1.3.4.8 PPO Km的测定

采用PPO最适反应pH值的缓冲液提取酶液。分别配制浓度为1.8、1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15、0.075、0.037 5、0.018 75、0.009 375、0.004 687 5、0.002 343 75 mol/L的邻苯二酚溶液，测定不同底物浓度下的PPO活力。3 mL反应体系中含1 mL邻苯二酚溶液，因而底物浓度[S]为邻苯二酚溶液浓度的1/3。根据不同的底物浓度[S]对应的反应速率V，求出两者的倒数，参照Lineweaver-Burk作图法，以1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图。拟合线性方程：y＝ax+b，得出最大反应速率（Vmax）＝1/b，米氏常数Km＝a×Vmax＝a/b。

1.4 数据统计与分析

各指标平行测定3 次，结果以平均值±标准差表示。数据统计分析采用SPSS 18.0软件，差异显著性检验采用邓肯氏多重比较法，差异显著性水平为0.05。采用Origin软件作图。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对鲜榨梨汁货架期色泽的影响

如图1所示，对照组梨汁褐变缓慢，货架期24 h时果汁色泽变化仍不明显，ΔE仅为0.56，小于人肉眼可识别的ΔE（1.5）。超高压处理前后（鲜榨和0 h时）梨汁色泽的差异不明显，但超高压处理加速了货架期褐变，表现为L*值快速下降，ΔE快速上升。货架期6 h时超高压处理组ΔE已达1.61，人肉眼可见明显的褐变；12 h后色泽的变化趋于缓慢，但仍逐渐上升。Triton X-100因可将膜蛋白从细胞膜上解离下来，是目前常用的检测结合态PPO的方法[10]。从图1可知，Triton X-100处理后色泽的变化仅略高于对照组，远小于超高压处理组，可推测超高压处理加速梨汁褐变与膜结合态的PPO关系不大。SDS是PPO激活剂之一[11]。从图1可知，超高压处理组色泽变化趋势与SDS组相似，可推测超高压处理激活了PPO，从而加速了褐变。同时，潜在酶活性是一种不同于膜结合态酶活性的新形式，游离态PPO和膜结合态PPO都可能存在潜在酶活性。

图1 超高压处理前后鲜榨梨汁货架期色泽L*值（A）和ΔE（B）的变化Fig. 1 Changes in L* (A) and ΔE (B) of HPP treated and untreated pear juice during shelf life

2.2 超高压处理对菌落总数、溶解氧质量浓度、总酚浓度和pH值的影响

表1 超高压处理对鲜榨梨汁菌落总数、溶解氧质量浓度、总酚浓度和pH值的影响Table 1 Effect of HPP treatment on total bacterial count, dissolved oxygen conconcentration, total phenol content and pH of fresh pear juice

如表1所示，超高压处理可以显著降低菌落总数，使菌落总数由2 867 CFU/mL降至28 CFU/mL，杀菌效果显著，达到99.0%。梨汁褐变主要是由PPO引起的酶促褐变。PPO是一类含铜的氧化还原酶，在氧气存在下催化酚类物质形成醌类物质，继而聚合形成褐色物质[12]。发生酶促褐变的三要素为：酚类底物、PPO和氧气。如表1所示，超高压处理后的溶解氧质量浓度与对照组差异不显著（P＞0.05），总酚浓度显著小于对照组（P＜0.05）。由此可知，超高压加速梨汁褐变与溶解氧和酚类底物无关。因此，加速褐变的原因只能与PPO有关。而超高压处理对梨汁pH值无显著影响，可排除pH值对PPO活力的影响。

2.3 PPO最适反应pH值分析

如图2所示，超高压处理后PPO最适反应pH值有两个，分别为pH 5.0和pH 7.0，分别记为PPO1和PPO2，但处理前最适pH值只有一个，为pH 5.0，pH 7.0处的峰不明显。超高压处理前PPO1活力为6.5 U/mL，处理后为14.1 U/mL，上升了1.17 倍。超高压处理前PPO2活力为2.6 U/mL，处理后为25.5 U/mL，上升了8.8 倍。由此可见，超高压处理使低活力甚至无活力的PPO表现出高催化活性，即产生了激活效应。

图2 pH值对超高压处理前后鲜榨梨汁PPO活力的影响Fig. 2 Effect of pH on PPO activity of HPP treated and untreated pear juice

2.4 PPO最适反应温度分析

图3 温度对超高压处理前后鲜榨梨汁PPO1（A）和PPO2（B）活力的影响Fig. 3 Effect of temperature on PPO1 (A) and PPO2 (B) activity of HPP treated and untreated pear juice

如图3A所示，超高压处理前后PPO1活力都表现为随温度升高先上升后下降的变化趋势，超高压处理前PPO1最适温度35 ℃，处理后最适温度为25 ℃。如图3B所示，超高压处理前后PPO2活力均表现为随温度升高而下降的趋势，其在5～25 ℃缓慢下降，25 ℃以后快速下降。最适反应温度为5 ℃，意味着超高压处理后的梨汁即使冷藏也极易发生褐变。

2.5 PPO热稳定性分析

如图4A所示，对照组45、55 ℃加热时PPO1活力变化不大，65 ℃加热时其活力缓慢上升，75、85 ℃加热时其活力先上升后下降，95 ℃加热时其活力快速下降。其中，75 ℃加热30 min时PPO1活力最高，为14.25 U/mL，与超高压处理后的PPO1活力相近（图2）。由此可见，65、75、85 ℃加热处理也具有PPO激活效应。但随着温度提高或者加热时间延长，PPO1活力开始下降，表现为钝化酶活力效应。因此可知，加热对鲜榨梨汁PPO1先激活后钝化，而对于已被超高压激活的PPO1，加热只表现出钝化酶活力效应（图4C）。Yemenicioglu等[13]在苹果中也发现了这一现象，他们采用3 个温度（68、73、78 ℃）加热处理PPO，发现其活力先上升后下降，认为苹果PPO存在潜在酶活力。Terefe等[14]研究表明，60～76 ℃热处理会导致蓝莓PPO活力上升。超高压处理前后45～95 ℃加热对PPO2只表现出钝化酶活力效应（图4B、D）；更低的温度（5～35 ℃）处理只是使其活力下降更慢或者不变，未见PPO2活力上升现象（数据未列出）。但不排除一定温度下长时间处理激活PPO2的可能。

图4 超高压处理前后鲜榨梨汁PPO1和PPO2的热稳定性Fig. 4 Thermal stability of PPO1 and PPO2 in HPP treated and untreated pear juice

2.6 PPO Km分析

图5 超高压处理对PPO酶促反应米氏方程曲线的影响Fig. 5 Effect of HPP treatment on Michaelis-Menten equation curve for PPO in fresh pear juice

如图5所示，PPO1和PPO2超高压处理前后的米氏方程曲线比较相似。随底物浓度的增加，超高压处理后的PPO酶促反应米氏方程曲线上升比超高压处理前更快。而且超高压处理后的米氏方程曲线更早出现平台效应。

表2 超高压处理对PPO酶促反应动力学参数的影响Table 2 Effect of HPP treatment on kinetic parameters of PPO in fresh pear juice

如图5和表2所示，计算得出超高压处理前PPO1的Vmax和Km分别为3.058 U和0.425 mol/L，PPO2的Vmax和Km分别为2.874 U和0.351 mol/L；超高压处理后PPO1的Vmax和Km分别为1.938 U和0.021 mol/L，PPO2的Vmax和Km分别为2.273 U和0.016 mol/L。PPO1 Vmax由3.058 U下降至1.938 U，下降了36.7%；PPO2 Vmax由2.874 U下降至2.273 U，下降了20.9%。

超高压处理后Vmax和Km都下降。由米氏方程V＝Vmax[S]/（Km+[S]）可知，Vmax下降导致V下降，Km下降导致V上升。PPO激活效应主要是由于Km的下降，即酶和底物之间亲和力1/Km的上升。PPO1与底物的亲和力从2.353 L/mol上升至46.909 L/mol，上升了18.9 倍；PPO2与底物的亲和力从2.852 L/mol上升至62.857 L/mol，上升了21.0 倍。由表1可知，鲜榨梨汁中总酚浓度约为0.90 mmol/L，代入米氏方程可知，超高压处理前后PPO1酶促反应速率分别为0.006 46 U和0.078 50 U，PPO2酶促反应速率分别为0.007 36 U和0.121 69 U，分别上升了12.2 倍和16.5 倍。超高压处理后Vmax对酶促反应速率的影响超过Km的影响，将会导致V下降，即产生钝化效应。

3 讨 论

3.1 超高压处理的激活效应

超高压处理（500 MPa、5 min）激活潜在PPO活力，加速鲜榨梨汁褐变。这一激活效应早有报道。曾庆梅等[7]研究表明，处理温度50 ℃、保压时间10 min、pH值为5的条件下，200～300 MPa处理梨汁时PPO被激活且活力最高，相对活力分别为115.3%和111.4%。苏光明等[15]研究表明，较低压力（100～300 MPa）的超高压处理对酱曲PPO有激活作用，200 MPa处理10 min能最大限度地激活酱曲PPO，此时其相对活力为135%。赵光远等[16]研究表明，400 MPa处理对PPO有激活作用，VC在500 MPa以下对梨汁中的PPO有激活作用，400 MPa不加VC和加VC后PPO相对活力分别为105.6%和119.7%。刘军伟等[17]研究表明，在温度30 ℃、保压时间10 min的条件下，压力在100～600 MPa范围内，500 MPa时紫薯PPO的活力最高，与未经超高压处理PPO活力之比为1.066。本研究结果表明，超高压处理后PPO1活力上升了1.17 倍，PPO2活力上升了8.8 倍，远超过以上报道，与Asaka等[18]的研究结果较一致，他们研究发现600 MPa、10 min超高压处理拉法兰西梨前后PPO活力分别为1.62、22.40 U/g，活力上升了12.8 倍。Terefe等[14]研究也发现500 MPa、30 ℃超高压处理蓝莓可激活PPO，其活力最大可上升6.1 倍。

3.2 超高压处理的钝化效应

超高压处理还具有钝化PPO的效应。如曾庆梅等[7]研究表明，处理温度50 ℃、保压时间为10 min，500 MPa处理时PPO的活力下降到75.3%。赵光远等[16]研究表明，500 MPa、60 ℃或750 MPa、50 ℃以上的处理条件可使鲜榨梨汁中的PPO失去60%以上的活力。刘军伟等[17]研究表明，600 MPa、65 ℃条件下处理35 min后，PPO活力最弱，抑制效果最佳。袁根良等[19]研究表明，压力480 MPa、温度55 ℃、保压时间10 min，在此条件下，香蕉果肉PPO活力残存率为0.90%。由于超高压处理技术自身存在的一些缺陷，实践中单一使用超高压难以使酶完全钝化，还需要采用更高的压力[20]、循环增压[21]、协同中温或者防褐变剂等技术。

3.3 PPO激活机制

PPO激活效应的内在原因是PPO存在潜在酶活性。潜在酶活性具有两个重要的特征：1）以潜在形式存在，本身活性较弱甚至无活性；2）一定条件下可被激活，激活后表现出高催化活性。现有的研究表明，很多果蔬中存在着潜在酶活性，如杏[22]、枇杷[23]、桃[24]、甜菜根[25]、蘑菇[26]等。本研究发现超高压处理后梨汁PPO最适反应pH值有两个，分别为pH 5.0和pH 7.0，即以PPO1和PPO2两种方式存在潜在酶活力。超高压通过影响蛋白质的分子体积、非共价键等，引起蛋白质分子结构的变化，进而改变其活力[27]。刘平等[28]研究认为高压处理改变疏水氨基酸的空间位置与酶活力中心的构象有关，高压处理后疏水氨基酸的暴露程度越小，酶活力越高。本实验证实超高压处理更有利于PPO分子与酚类底物接触，使PPO与底物之间的亲和力更高，从而提高了酶促反应速率。超高压是激活PPO潜在酶活性的外在原因之一，除本实验证实的潜在酶活性可被SDS处理、热处理激活外，其还可被Cu2+、脲、胍盐和限制性蛋白酶解[18]等方式激活。

除了PPO，还有过氧化物酶、果胶甲酯酶、脂肪酶、β-葡萄糖苷酶等25 种酶可被超高压激活[29]。这些与果蔬生理代谢密切相关的酶都可能存着潜在酶活形式。不同于化学和生物因素，压力和温度属于纯物理变量，意味着环境因素可直接作用于果蔬体内的酶，进而改变果蔬生理代谢途径。因此，进一步研究潜在酶活性及其作用具有重要的理论价值和应用意义。

综上，超高压处理鲜榨梨汁存在激活和钝化两种效应。激活效应的内在原因是PPO存在潜在酶活性形式，其本身活性较弱甚至无活性，超高压处理是激活PPO潜在酶活性的外在原因之一，SDS处理、热处理等也可激活PPO潜在酶活性。超高压处理降低PPO的Km，提高其与底物之间的亲和力，从而提高酶促反应速率，加速鲜榨梨汁褐变。超高压处理同时会降低Vmax，Vmax对酶促反应速率的影响如超过Km的影响，将会表现出钝化效应。