不同接种物对木薯乙醇废液高温厌氧发酵的影响

卞志明 ，赵明星 ， 廖家林 ，阮文权 *

（1.江南大学 环境与土木工程学院，江苏 无锡 214122；2.江苏省厌氧生物技术重点实验室，江南大学，江苏 无锡214122）

新鲜木薯或木薯干作为原料发酵生产乙醇的过程中每生产1 t乙醇需排放废水约15 t[1]。木薯乙醇废液是一种高含固率、高COD和低pH的高浓度有机废水，但这种高浓度有机废水本身也是一种潜在的可利用资源，在处理过程中若能高效利用，不仅可解决其环境污染问题，而且能增加企业的经济效益。

当前，厌氧发酵技术在处理该类高浓度有机废水领域已成为主要的方法之一，可将有机物质转化为可再生的清洁能源沼气[2-3]，但是厌氧发酵过程中也容易受到众多环境因子的影响，其中接种微生物的性质是决定厌氧发酵效率的关键因素之一。Syutsubo等[4]通过接种高温纤维素富集微生物培养获得菌株J3作为厌氧发酵微生物，结果表明，菌株J3具有良好的纤维素降解效果。何江等[5]从富含腐烂纤维质的环境中取样，以木薯渣及滤纸为碳源的蛋白胨纤维素培养基不断地富集培养，构建了一组高效稳定的纤维质分解复合菌群作为接种微生物，结果表明，该复合菌群具有高效的纤维质分解效果。由此可见，接种微生物的种类和性能对厌氧发酵至关重要。除了构建高效纤维质降解菌种之外，针对采用不同厌氧反应器中的污泥作为接种物的研究方法也有报道。陈金荣等[6]以某乙醇厂UASB中颗粒污泥作为接种污泥处理木薯乙醇废液，韦雪梅等[7]采用某糖厂厌氧污泥池中的厌氧活性污泥和县城生活污水处理厂的剩余活性污泥作为厌氧发酵接种污泥，处理木薯乙醇废液。在厌氧发酵过程中，不同接种物的酶活对反应效率也有较大的影响。厌氧发酵过程中相关酶活如脱氢酶、辅酶F420和纤维素酶活性等可以反映体系的稳定性以及不同物质降解和生成的效率。因此，分析关键酶活性与代谢产物之间的关联，对物质转化和降解机理具有重要的指导意义。然而，不同的接种污泥在功能菌群组成成分和结构上存在一定的差异性，对不同混合污泥在实际处理木薯乙醇废液过程中发酵特性的差异性仍需深入研究，同时对厌氧发酵过程中的关键酶系和代谢产物之间的关系也需要进行探讨。

本研究评价了4种不同性质的接种污泥对木薯乙醇废液高温厌氧处理的影响，通过反应过程的参数分析，研究不同接种物之间的差异性，获得乙醇废液厌氧处理的最佳模式，为木薯乙醇废液的工业化处置提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

底物：木薯乙醇废液，取自镇江长兴乙醇厂，其基本特性见表1。

4种污泥的性质见表2。接种污泥分别为镇江某乙醇厂的高温厌氧污泥、实验室保存的牛瘤胃与絮状污泥组成的中温复配污泥，该污泥是絮状厌氧污泥与牛瘤胃微生物按照VS 1∶1的比例在中温35℃的CSTR反应器中经过长时间的运行反应而得到的复配污泥、无锡某食品加工厂的中温厌氧颗粒污泥和无锡某糖精加工厂的中温厌氧絮状污泥。

表1 木薯乙醇废液水质特性Table 1 Characteristics of cassava alcohol wastewater

表2 4种不同接种污泥的性质Table 2 Characteristics of four different inoculation

1.2 实验装置

实验反应装置由3个部分组成：500 mL玻璃反应瓶，专用集气袋和恒温振荡水浴锅。反应瓶有效体积为450 mL，反应温度为55℃，摇床振荡频率为35 r/min，共设置4组不同的接种污泥实验。实验中每个反应瓶中接种一定量的污泥和经过稀释6倍的废水，用去离子水补充至450 mL，接种污泥浓度为 9 gVS/L，TCOD 为 12 000 mg/L，SCOD 为 6 000 mg/L。各实验组设置3个平行，同时设置空白组，文中的数值为3组的平均值。反应开始前向反应装置中通入5 min的氮气以排空装置中的空气，采用橡皮塞密封，整个发酵时间为15 d。

1.3 测定方法

TS/VS采用灼烧减重法测定[8]；纤维素、半纤维素和木质素的成分采用范式法[9]；脂肪采用索氏提取法[10]；脱氢酶采用分光光度法[11]；辅酶F420采用分光光度法[12]；纤维素酶和半纤维素酶是将发酵液在5 000 r/min离心5min后取上清液，羧甲基纤维素酶（CMCase）和木聚糖酶酶活测定参照文献[13]。酶活定义：1 mL粗酶液1 min酶解底物产生1 g还原糖定义为一个酶活力单位U；SCOD是将样品经0.45 μm的微孔滤膜过滤后，利用重铬酸钾法测定，具体参考国家水和废水检测分析方法[14]；总VFA采用比色法测定[15]。

2 结果与分析

2.1 SCOD变化情况

不同实验组SCOD质量浓度的变化见图1。4种不同接种污泥组基本上都呈现先上升后下降的趋势，除了中温颗粒污泥组外，其他3组未有明显的SCOD累积现象。高温絮状污泥组和中温复配污泥组SCOD在厌氧消化的第4天和第5天达到最大值，分别为6 519.0 mg/L和6 681.6 mg/L。中温颗粒污泥组在第5天达到最大值6 148.6 mg/L。中温絮状污泥组在第1天和第5天达到两个高峰，分别为7 686.1 mg/L和7 182.2 mg/L。随着发酵的进行，4组的SCOD都有不同程度的下降，至反应结束时，高温絮状污泥组、中温颗粒污泥组、中温复配污泥组和中温絮状污泥组的SCOD质量浓度分别为1 672.4、4 927.7、3 148.704、1 671.4 mg/L， 其 4 组SCOD的降解率分别为 72.1%、17.8%、47.5%和72.2%。由此可见，高温絮状污泥组和中温絮状污泥组具有较好的SCOD去除效率。微生物可以将木薯乙醇废液中的固体物质转化为可溶性的小分子物质，使得反应过程中各组SCOD的升高，这不仅提高了废液的可再生能源回收利用率，也减少了对周围环境的危害。

2.2 沼气产气率

图2为4种不同接种污泥组沼气产气率。可知，高温絮状污泥和中温絮状污泥组具有较好的产气效果，沼气产率分别为188.8、182 mL/gTCODadded。中温颗粒污泥组沼气产率最低，仅为53.7 mL/gTCODadded，中温复配污泥组沼气产率为109 mL/gTCODadded。不同沼气产量反映了不同厌氧体系的产沼气潜力。经过15 d的厌氧发酵后，中温颗粒污泥组的沼气产量较低，这是由于整个发酵过程中反应体系处于酸化状态，抑制了产甲烷菌群的生长，因此，适当调节发酵体系中的pH值有利于沼气产量的提高。

图1 4种不同污泥组SCOD变化情况Fig.1 Change of SCOD in four different sludge groups

图2 4种不同接种污泥组沼气产率的情况Fig.2 Biogas production rate of four different sludge groups

2.3 反应体系pH和VFA的变化

pH是衡量和评价厌氧发酵过程的重要影响因子，产甲烷菌最适pH范围在6.8～7.2之间[16]。鲁真等[17]认为厌氧过程中微生物释放的酶只有在合适的pH生长范围之内才能发挥最大活性，系统内pH过高过低都会影响酶活力，进而影响微生物细胞内生物化学过程。图3为在厌氧发酵过程中各组pH的变化情况。可知pH整体上呈现先下降后上升的趋势。中温絮状污泥组pH始终在7.0以上，高温絮状污泥组前2天pH低于6.8，第2天最低为6.7。中温复配污泥组前5天pH都低于6.8，并在第1天时达到最低值6.6，反应初始阶段处于弱酸化状态，从第6天开始，pH恢复至正常产甲烷状态。Liu等[18]研究认为，pH先下降后上升现象符合复合菌群降解含有大量木质纤维素类物质过程的规律，同时也是复合菌群正常分解能力的体现，本实验与其研究结果较一致。中温颗粒污泥组在整个发酵过程的pH一直低于6.8，并在第5天达到最低值5.88，系统始终处于酸化状态。中温絮状污泥组pH始终在7.0以上，并在第7～9天pH处于8.0以上，这可能是由于接种来自处理含氮物质废水的中温絮状污泥中含有一定量的含氮物质，在发酵过程中形成NH4+，导致系统pH升高。

图3 4种不同反应组pH变化Fig.3 pH in four different groups

图4 是4组实验组发酵过程中VFA质量浓度变化情况。从图4可知，VFA质量浓度变化总体上呈先上升后下降的趋势。因为，在发酵初始阶段，由于产酸菌占主导地位，基质被产酸菌代谢成各种有机酸，此时产甲烷菌活性较低，产生的挥发性有机酸无法迅速转化为沼气而不断累积，随着发酵的不断进行，产甲烷菌逐渐适应了体系环境，产甲烷能力不断提升，使得挥发性有机酸浓度不断降低。高温絮状污泥、中温复配污泥、中温颗粒污泥组在第4天时VFA质量浓度达到最大值，分别为5 247.8、7 127.7、7 929.4 mg/L，中温絮状污泥组在第3天达到最大值，为6 108 mg/L。随着发酵的进行，VFA质量浓度不断降低，至反应结束时，高温絮状污泥、中温复配污泥、中温颗粒污泥、中温絮状污泥组VFA质量浓度分别为695.0、830.7、3 361.8、791.6 mg/L。

图4 4种不同反应组VFA变化Fig.4 VFA in four different groups

2.4 反应体系中酶活性的变化情况

图5 为4组厌氧发酵过程中脱氢酶活性变化情况。可知，中温颗粒污泥组的脱氢酶活性在第2天时达到最大，为 68.9 TFμg/（mL·h），之后不断下降。其他3个污泥组脱氢酶活性呈现先上升后下降的趋势。高温絮状污泥、中温复配污泥和中温絮状污泥组分别在第3天、第9天和第5天达到最大值，为 67.8、80.1、77.3 TFμg/（mL·h）。 中温复配污泥组酶活性达到最大值的时间相比其他反应体系有滞后现象，这可能是因为由大量纤维质降解菌组成的中温复配污泥组在降解木薯乙醇废液过程中需要更长的适应时间，才能够获得更好的纤维质降解能力，较高的酶活力也表明了对底物具有良好的转化能力。李美群等[19]在研究酒糟发酵过程中发现，厌氧纤维素菌的增长较缓慢。

图5 脱氢酶活性的变化Fig.5 Dehydrogenase activity in four different groups

微生物降解木薯乙醇废液过程中，微生物分泌的水解酶系，如纤维素、半纤维素等酶，从而破坏和分解纤维素半纤维素等不溶性大分子物质的结构，然后再降解和转化为更加简单的糖类、脂肪酸和氨基酸等小分子物质[20]。

图6为4种不同接种污泥厌氧发酵过程中纤维素和半纤维素酶活性变化情况。从图6可知，高温絮状污泥、中温絮状污泥组的半纤维素酶和纤维素酶酶活性在第5天时达到最大，分别为10.6、18.7 U和24.6、28.7 U。中温颗粒污泥组在第3天半纤维素酶和纤维素酶活性达到最大值，分别为9.79、5.5 U。中温复配污泥组在第9天半纤维素酶和纤维素酶活性最大值，分别为48.2 U和51.3 U。4个实验组纤维素和半纤维素酶活性整体上呈先升后降的趋势。在出现峰值之后，水解酶活性呈逐渐下降趋势，这可能是因为随着厌氧过程的不断进行，体系内的营养物质和中间代谢产物的累积导致微生物活性降低，并抑制了相关的酶活性。

图6 纤维素和半纤维素酶活性的变化Fig.6 Cellulosic and hemicellulosic enzyme activity in four different groups

辅酶F420是产甲烷菌特有的一种辅酶。Delafontaine等[21]提出了用辅酶F420作为厌氧发酵过程中产甲烷能力的度量指标。实验过程中辅酶F420变化见图7。可知，高温絮状污泥和中温絮状污泥组在第8天时达到最大值，分别为0.022、0.024 μmol/gvss。中温颗粒污泥组辅酶F420从第2天开始不断下降，第5天时达到最小值0.006 μmol/gvss，这可能是由于中温颗粒污泥组发酵过程中始终处于酸化状态，抑制了产甲烷菌的生长和繁殖，使得反应体系中辅酶F420受到一定程度的抑制。同时中温复配污泥组辅酶F420在第12天时达到最大值 0.016 μmol/gvss，但相比于其它3组的最大值，该组较低，这可能是因为由大量的瘤胃微生物组成的中温复配污泥组，而瘤胃微生物在自然环境中具有弱产甲烷菌体系特征，使得产甲烷菌活性较低，因此在厌氧发酵过程中产甲烷能力较弱。除中温颗粒污泥组外，其他三个污泥组辅酶F420均呈先上升后下降的趋势。

图7 辅酶F420的变化Fig.7 Coenzyme F420 in four different groups

2.5 木薯乙醇废液中固体物质的降解效果及其对理论产甲烷的贡献率

木薯乙醇废液中固体物质的降解效果见图8。可知，高温絮状污泥、中温颗粒污泥、中温复配污泥和中温絮状污泥组经过15 d的厌氧发酵，木薯乙醇废液中粗纤维降解率分别为25.8%、16.1%、41.5%、29.4%。Zhen等[22]认为接种牛瘤胃微生物的厌氧反应器对木质纤维素类废水具有更高的有机物质转化率。中温复配污泥组表现出较好的降解率，这可能是因为中温复配污泥中的牛瘤胃微生物起到了一定的降解作用。与此同时，由关键酶活性与粗纤维降解效果分析可知，关键酶活性与粗纤维降解率具有一定的相关性，但在实际的纤维质厌氧分解过程中，酶的释放和酶活性会受到各种因素的干扰和影响，如底物中各成分含量、底物结构的复杂性以及与底物的吸附性能等[23]。

图8 不同接种污泥组粗纤维降解率的变化Fig.8 Crude cellulose degradation rate of four different sludge groups

同时，为了分析不同有机物质降解率对理论总甲烷产量的贡献率，利用Buswell方程[24]进行理论产甲烷贡献率计算：

利用公式（1）可知，纤维素（C6H10O5）、半纤维素（C5H8O4）和脂肪（C57H104O6）的理论产甲烷贡献率分别为 414.8、424.2、1 013.45 mL CH4/g dry。

表3为4个不同反应体系各有机物质降解效率。可以看出，b组纤维素和半纤维的降解效率最大，a和d组相近，c组最小。表4为木薯乙醇废液中有机物质降解效率对理论产甲烷的贡献率。计算结果可得，纤维素和半纤维素对理论产甲烷贡献率最大，这表明纤维素和半纤维的降解效率对理论产甲烷具有重要的贡献作用。

表3 不同反应体系各有机物质降解效率Table 3 Removal rate of different organics in each digested group

表4 各有机物质降解效率对理论产甲烷的贡献率Table 4 Methane potential attributable to the removal performance of each digested organic compound

3 结语

通过评价4种不同接种污泥在处理木薯乙醇废液过程中的发酵特性，分析和比较它们之间的差异性，得出以下结论：1）4组实验中，高温絮状污泥、中温复配污泥、中温颗粒污泥和中温絮状污泥组4个反应组中SCOD去除率分别为72.1%、47.5%、17.8%、72.2%， 沼气产率分别为 188.8、109、53.7、182 mL/gTCODadded；2）中温复配污泥组具有较好的纤维素和半纤维素酶活性，并在第9天半纤维素酶和纤维素酶活性最大，分别为48.2 U和51.3 U，中温颗粒污泥组酶活性较差，在第3天半纤维素酶和纤维素酶活性达到最大，分别为9.79和5.5 U；3）经过15 d厌氧发酵，高温絮状污泥、中温复配污泥、中温颗粒污泥和中温絮状污泥4个反应组对木薯乙醇废液中粗纤维降解率分别为25.8%、41.5%、16.1%、29.4%，这表明中温复配污泥组对木薯乙醇废液中纤维质成分具有良好的降解能力。

不同接种污泥对木薯乙醇废液的降解效果不同，这可能是由于组成污泥的微生物菌群的差异性导致的，因此，要深入了解不同接种污泥之间的降解机理，需要对发酵过程中微生物群落的变化和功能进行深入的研究。