转录因子FOSB mRNA 5′非翻译区内部核糖体进入位点的活性

马 晶，孙柳柳，马文囡，陶义芬，陈 蕴，朱瑞宇，金 坚

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B（FBJmurine osteosarcoma viral oncogene homolog BFOSB或FOSB）是Fos转录因子家族的一员，与细胞的增殖、分化、转化及肿瘤发生密切相关。Fos家族包括4种转录因子：FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2， 这些基因能够编码亮氨酸拉链蛋白，与其它蛋白质形成同源或异源二聚体，二聚体与靶基因的碱性激活因子-1（Activatingprotein-1，AP-1）结合，以调节靶基因的表达[1]。FOSB基因的蛋白质产物除全长的FOSB外，还存在一个在C端比FOSB短101个氨基酸残基的DeltaFOSB蛋白[2]，它是一种FOSB的较短的剪切形式，但比FOSB更为稳定，在治疗慢性上瘾症状中扮演着重要的角色[3-6]。而FOSB基因不仅与药物成瘾相关，也与乳腺癌和卵巢癌的发生有关，在诱导因子的作用下会引起三阴性乳腺癌细胞的死亡[7-9]。最近研究发现，FOSB基因有望成为血管内皮瘤细胞及胃癌细胞的有效生物标记物[10-11]，而对FOSB基因蛋白表达调控机制的研究，很少报道。

真核生物中经典的翻译机制是帽依赖型的翻译起始机制，需要mRNA上的帽子结构和真核翻译起始因子来招募核糖体进而起始翻译。然而在病毒中，存在着另一种更为高效的翻译起始机制，即非帽依赖型翻译起始机制，其mRNA并没有帽子结构，核糖体的40S小亚基直接通过识别mRNA序列结构或mRNA的5’非翻译区（5’UTR）起始翻译。其mRNA 5’UTR上核糖体能识别的序列称为内部核糖体进入位点（（internal ribosme entry site，IRES）[12]。事实上，在真核生物中，也已发现许多转录因子的mRNA具有IRES活性，而这些转录因子大多与细胞增殖、分化、凋亡以及细胞耐药等有关，如血管内皮生长因子 （Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）[13]、NF-κB 抑 制 因 子 （NF-κB repressing factor，NRF）[14]、原癌基因 c-myc[15]、DNA 损伤结合蛋白 2（DNA damage-binding protein 2，DDB2）[16]、核糖体结合蛋白 1（Ribosome Binding Protein 1，RRBP1）[17]等。而已发现的IRES元件通常5’UTR偏长、GC含量丰富、二级结构复杂。FOSBmRNA 5’UTR符合上述IRES的基本特征，作者将FOSBmRNA 5’UTR的基因序列插入到研究IRES活性常用的双荧光素酶报告质粒（pRL-FL）中，检测其是否有IRES活性并初步探究其IRES的结构与功能。

1 材料与方法

1.1 实验材料

在实验室初期构建并保存真核表达载体即双荧光素酶报告载体pRL-FL以及去启动子载体pRL-FL△SV40；大肠杆菌DH5a：天根生化科技有限公司；DNA限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ：Fermantas公司；T4 DNA连接酶和prime STAR HS DNA聚合酶：TaKaRa公司；重组质粒pRL-FOSBFL：作者构建；重组质粒pRL-c-myc-FL：中美泰和购买，DMEM、RPMI1640培养基和胎牛血清：美国Gibco公司；人胚肾细胞HEK293、人卵巢癌细胞A2780/WT、人结肠癌细胞HCT-8/WT、人肝癌细胞Bel-7402/WT及宫颈癌细胞Hela/WT：均保存于作者所在实验室的液氮罐中；紫杉醇，顺铂药物：Sigma公司；LipofectamineTM 2000：美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Dual®Luciferase Reporter Assay System）：美国Promega公司；其他试剂均为分析纯试剂。

1.2 表达载体的构建

FOSB 5’UTR cDNA 序列 （NM_001114171）由生工生物工程（上海）有限公司合成，合成序列含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点。FOSB5’UTR的全长基因序列和实验所需的各截短基因序列均以重组质粒pRL-FOSB-FL为模板进行扩增，在SV40启动子的载△pRL-FL上插入FOSB5’UTR的全长基因序列，构建△pRL-FOSB-FL；同时又载体pRL-FL上插入各截短片段，构建出的截短片段的重组质粒分别为 pRL-FOSB-J1-FL （-376 to-1）、pRL-FOSBJ2-FL（-592 to-217）、pRL-FOSB-J3-FL（-592 to-377）、pRL-FOSB-J4-FL （-188 to-1）、pRL-FOSBJ5-FL（-377 to-217）。将各重组质粒转化到感受态大肠杆菌Escherichia coliDH 5a中，涂板摇菌后，将菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，质粒截短PCR所用引物见表1，其中下划线是NdeI和EcoRI的酶切位点和保护碱基。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 构建截短质粒PCR所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in PCR for deletion plasmids construct

1.3 细胞培养与转染

人胚肾细胞HEK293、人卵巢癌细胞A2780/WT、人宫颈癌细胞Hela/WT培养于DMEM完全培养基（加10%的血清），而肝癌细胞Bel-7402/WT和结肠癌细胞HCT-8/WT培养于RPMI 1640完全培养基（加10%的血清），待细胞长至80%～90%时，用胰酶消化传代，待细胞再次长至80%～90%时，铺细胞于24孔板，铺板后第二天加入100 uL的opti-MEM，1 ug的质粒以及 2 uL的 LipofectamineTM 2000混匀，孵育25 min，加入已换好液的24孔板中，培养 18～24 h后将细胞用 1×PLB（Passive Lysis Buffer）裂解，收于-80℃待用。

1.4 双荧光素酶检测活性

在24孔板中铺细胞（70%～80%），细胞贴壁后（16～24 h）将质粒转染进细胞中，24 h后取出24孔板，用PBS洗两遍，可轻微振荡，并用枪头将残留PBS 吸干，加 100 uL 1×PLB（Passive Lysis Buffer）到每个孔中去裂解细胞，并在摇床上充分裂解15 min后，用枪头吹打板底并收集细胞裂解液，将待检样置于-80℃中保存。对双荧光素酶的活性检测时，准备干净的Corning Costar 96孔白板，先加入20 uL的细胞裂解液，接着将加过裂解液的孔板放在GloMaxTM_96孔板发光检测仪上，然后加入100 uL的萤火虫荧光素酶底物（LARⅡ），在充分混合后迅速地测定其荧光值，最后加入100 uL的反应终止液海肾荧光素酶底物（Stop&Glo®reagent），使之充分混匀后，再测其荧光值。IRES的活性以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值表示（即Fluc/Rluc）。

1.5 统计学分析方法

本研究所有的数据均用GraphPad Prism 5.0软件分析，统计数据采用SEM表示，组间比较采用Student t检验分析统计学差异。 *：P<0.05；**：P<0.005；***：P<0.000 5。

2 结果与分析

2.1 FOSB序列与结构分析

在NCBI里搜索FOSB序列发现，FOSB序列较长（592 bp）（见图 1（a））且 GC 含量偏高（56.5%），在各种族间序列同源性较高达到55.74%（见图1（b））。而用RNA Folding Form模拟其二级结构（见图 1（c）），可以看出 FOSB 5′UTR 可以形成稳定且复杂的二级茎环结构（ΔG=-202.87 kcal/mole），存在潜在的IRES元件。

2.2 FOSB mRNA 5’UTR IRES活性初步确定

FOSBmRNA 5’UTR是否含有 IRES活性，目前仍要借用工具质粒，而检测mRNA是否有IRES元件，国际上较为通用的是双顺反子报告载体的方法，由帽依赖型机制来起始载体中的第一个顺反子翻译，在载体上游顺反子的3’端和下游顺反子的5’端间插入有潜力的IRES元件，来介导下游顺反子的翻译[18]。而本研究中用到的双荧光素酶报告载体，上游是萤火虫荧光素酶（FL），下游是海肾荧光素酶（RL）。如图2（a）所示，在RL和FL之间有许多克隆位点，将基因目的片段克隆到I两个酶切位点（NdeI和EcoR）之间，通过两个荧光素酶活性比值的大小，来判断目的基因是否具有IRES活性，如FL比RL的活性较高时，可初步认为该目的基因有潜在的IRES元件。作者将FOSB5’UTR序列和阳性对照c-myc 5’UTR序列分别插入到报告载体pRL-FL两个阅读框中间构建目的载体pRLFOSB-FL、pRL-c-myc-FL（图 2（b）），其中阳性对照与阴性对照分别是pRL-c-myc-FL与pRL-FL。然后将这三种质粒分别转染进人胚肾细胞HEK293中，收集细胞裂解液，24 h后，接着通过双荧光素酶分析实验得到Fluc/Rluc的值。结果pRL-FOSB-FL活性远大于阴性质粒（***，P<0.000 5），且与阳性质粒pRL-c-myc-FL活性相似，初步确定FOSBmRNA 5’UTR中存在假定的IRES元件。

虽然双荧光素酶报告基因检测系统已相对成熟，但如果插入的检测序列中有内部启动子，就会在细胞内形成含有下游萤火虫荧光素酶的单顺反子mRNA的存在，从而影响实验结果的判断。为了排除这种潜在的可能性，于是将载体pRL-FL中的SV40启动子删除，从而得到新的载体ΔpRL-FL（图2（c）），接着仍将FOSBmRNA 5’ UTR 基因克隆到这个载体的两个酶切位点（NdeI和EcoRI）之间，如FL有高表达，则目的基因中有隐含启动子，反之没有内部启动子。将FOSB克隆到载体△pRL-FL上得到△pRL-FOSB-FL，分别将pRL-FOSB-FL与△pRL-FOSB-FL瞬转染入人胚肾细胞HEK293中，24 h后收集细胞并充分裂解，通过1.5实验步骤可得 Fluc/Rluc的值。如图 2（d）所示，△pRL-FOSBFL的RL与FL值均远小于pRL-FOSB-FL的值（***，P<0.000 5），所以FOSB不含有内部启动子，进一步证明FOSBmRNA 5’UTR具有IRES活性。

图1 FOSB mRNA 5’UTR序列与结构分析Fig.1 Sequence and structure analysis of FOSB mRNA 5’UTR

2.3 FOSB mRNA 5’UTR IRES活性中心的鉴定

对FOSB 5’UTR IRES元件活性中心域的的探究，通过RNA Folding Form软件来模拟FOSBmRNA 5’UTR全长序列的二级结构，并对其二级结构进行分析，分别构建了5个截短质粒：pRLFOSB-J1-FL（-376 to-1）、pRL-FOSB-J2-FL（-592 to-217）、pRL-FOSB-J3-FL （-592 to-377）、pRLFOSB-J4-FL（-188 to-1）、pRL-FOSB-J5-FL（-377 to-217）。将pRL-FOSB-FL以及各截短质粒瞬转染入人胚肾细胞HEK293与肝癌细胞Bel-7402中，24 h后收集细胞裂解液用于测定Fluc/Rluc（见图3（a）），两种细胞的测活结果基本一致。首先从5’端开始截短，发现-376至-1活性仅降为全长活性的75%左右，说明5’端可能对其活性贡献较大；继续截短发现在-188至-1活性降为全长的21%～30%，猜测可能中间片段对其IRES活性贡献更大；为了验证其3’端的重要性，对3’端进行截短，发现-592至-377活性下降了75%左右，证明3’端对其IRES活性确实重要，但是截到-217（即-592至-217）时活性又增加到全长的60%左右，怀疑其活性中心序列可能是位于中间的-376至-217，并将该片段插入到双顺反子载体pRL-FL中。如图3（b）所示，截短质粒-376至-217与全长活性相比，展现出为全长活性的70%～85%，从而判断确定其IRES活性中心为-376至-217，即-376至-217对最高活性的贡献较大。结果显示FOSB mRNA 5’端非翻译区-376至-217序列可能是其IRES活性重要活性区域，而其两端序列可能抑制其IRES的活性。

图2 FOSB mRNA 5'UTR IRES活性初步确定Fig.2 Activity of FOSB mRNA 5'UTR IRES preliminary determined

2.4 FOSB mRNA 5’UTR在各细胞中的IRES活性

从上述实验不难发现，FOSBmRNA 5’UTR在HEK293细胞与Bel-7402/WT细胞中IRES活性不同，其中在肝癌细胞Bel-7402/WT中活性较高。为了继续探究其IRES活性在癌细胞中是否是异常表达，作者将重组质粒pRL-FOSB-FL转染进另外3株癌细胞包括人卵巢癌细胞A2780/WT、人结肠癌细胞HCT-8/WT、人宫颈癌细胞Hela[19]。24 h后收集细胞裂解液，测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性并计算其比值（Fluc/Rluc）。如图4所示，在不同细胞中FOSBmRNA 5’UTR IRES活性有着明显的区别，其中与HEK293细胞相比，A2780/WT中的活性较高（***，p<0.000 5），Hela 与 Bel-7402/WT细胞的活性也高于 HEK293 细胞（*，p<0.05；**，p<0.005）。而大多数文献报道[20]，IRES的活性与细胞中 IRES 结合蛋白（IRES trans-acting factors，ITAFs）的表达量有密切关系，可能在这些癌细胞中，其ITAFs表达量较高，这需要进行进一步的研究。

图3 重组质粒pRL-FOSB-FL及其截短转染细胞的IRES的相对活性Fig.3 Relative IRES activities of cells transfected with recombinant plasmids pRL-FOSB-FL and its deletions

2.5 FOSB mRNA 5’UTR在细胞压力下的IRES活性

将重组质粒pRL-FOSB-FL转染进肝癌细胞Bel-7402/WT中24 h以后，分别用药物紫杉醇（PTX）和顺铂（DDP）处理细胞，PTX 的使用质量浓度分别为 0、0.25、0.5 ug/mL，DDP 的使用质量浓度为 0、0.5、1 ug/ml），加药培养 18 h，在两种药物中，随着药物质量浓度的增加，其IRES活性均呈现逐渐上升的趋势，见图5。说明IRES作为一种应激翻译起始机制，在药物刺激下FOSBIRES活性会增加，另外在紫杉醇刺激下比顺铂更为明显 （*，p<0.05；**，p<0.005），可能与药物不同的作用机制相关。

图4 重组质粒pRL-FOSB-FL转染各个细胞的荧光素酶的相对活性Fig.4 Rletive luciferase activity of pRL-FOSB-FL in various cell lines.（*，p ＜0.05；**，p ＜0.005；***，p ＜0.000 5；student t test）.The expression data are presented asthemean + SEM oftriplicate samples

图5 细胞压力条件对Bel-7402细胞中FOSB IRES活性的影响Fig.5 FOSB IRES activity in Bel-7402 cells during different cell stress （*，p＜0.05；**，p＜0.005；***，p＜0.000 5；student t test）.The expression data are presented asthemean + SEM oftriplicate samples

3 结语

在真核生物内环境稳定状态下大多以帽依赖型机制进行翻译，而真核细胞处于细胞压力条件（低氧、饥饿、药物刺激），此时细胞的生长、分化及凋亡会使细胞的稳态迅速打乱。这时帽依赖的翻译效率会降低，而此时IRES介导的翻译却会增加，进而使细胞继续维持稳态环境。FOSB作为立早基因中的一员，在多种刺激后会立即表达，从而产生不同的转录因子，进而调控其他基因的转录与表达来维持细胞的生长、发育和分化[21]。最新的报道显示，FOSB基因在抗癌药物的刺激下在细胞增殖速率增加[22]，故作者在研究FOSBmRNA 5'UTR活性的同时，对其进行加药刺激，发现其不仅具有IRES活性，并且其在抗癌药物（紫杉醇和顺铂）刺激下IRES活性增加，这或许与IRES是一种应激翻译机制，能够维持IRES在细胞压力条件下的基本表达密切相关。另外FOSB/ΔFOSB作为慢性成瘾的关键分子转换机制，在成瘾药物慢性刺激后出现累积现象，并表现出独特的高度稳定性[23]，这暗示着FOSBmRNA 5'UTR的IRES活性可能与其在药物刺激下的稳定表达有关。

据文献报道，具有IRES活性的RNA有以下特征：1）富含 GC 碱基；2）较长的 5'UTR；3）二级结构较复杂。决定IRES功能的因素是IRES元件的序列结构以及其反式作用因子（ITAFs），故IRES元件研究的热门总是去寻找其序列结构抑或者机制上的共性。而作者通过截短分析发现了FOSBmRNA 5'UTR IRES活性中心位于其5'UTR的-376至-217之间，并通过将该片段连接到双顺反子载体再次验证-376至-217的IRES活性。相较于国内外已报道的细胞内的IRES元件，FOSBIRES元件在序列与结构上相似度均不高，但是通过在NCBI里面进行序列搜索，并在DNAMAN中对其物种间同源性进行比对，发现种族间相似性达55%以上，其同源性位置包括其活性中心，IRES的活性序列位于FOS基因种族保守序列中，这间接说明了FOSBIRES序列的保守性，暗示IRES元件在Fos家族中具有相对稳定性。

FOSB/Delta FOSB与药物成瘾的机制研究较多，而其与肿瘤形成的机制鲜少提到，其实FOSB与乳腺癌和卵巢癌的形成密切相关，而目前的研究显示，在FOSB基因在乳腺癌、卵巢癌、胃癌及肺癌等多种癌细胞中发挥重要的作用，这或使FOSB基因成为某些肿瘤的诊断标志物，用于肿瘤的预防。而本研究中选用不同的癌细胞测其IRES活性，发现FOSBIRES活性在不同的癌细胞中明显不同，在卵巢癌细胞中活性较高，这为其成为肿瘤诊断标志物提供了另一种思路。