体外法评估9种植物精油对产气荚膜梭菌的抑菌效果研究

◆作者：欧阳海燕 沈兆艳 吕勇 吴世林

◆单位：广州智特奇生物科技股份有限公司

由于药物的残留、病原菌的耐药性等问题，抗生素逐渐被限制在饲料中使用。植物精油以其天然、安全、高效等优点可成为抗生素的替代品。国内外研究表明，天然植物精油对日常生产生活中的致病菌有很好的抑制作用。Fang等（2009）报道，将 1g/kg刺五加精油添加到21日龄断奶仔猪的饲粮中，仔猪肠道大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的数量显著降低。Michiels等（2009）研究表明，百里香酚能够显著提高仔猪空肠和盲肠中乳酸杆菌的数量，降低空肠中的厌氧菌、梭菌和链球菌的数量。植物精油对细菌的抑制作用具有广谱性，既能抑制革兰氏阳性菌，又能抑制革兰氏阴性菌。产气荚膜梭菌是一类革兰氏阳性厌氧菌，可产生芽孢，是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌。Ouwehand等（2010）报道，致病性的大肠杆菌、产气荚膜梭菌和沙门氏菌可被牛至精油、迷迭香精油、百里香精油以及香芹酚、百里香酚、肉桂醛、柠檬醛和柠檬烯等单品所抑制，而这些物质对肠道有益菌如罗伊氏乳杆菌、长双歧杆菌和短双歧杆菌的抑制作用较弱。

本试验研究香芹酚、天然肉桂醛、丁香酚、合成牛至油、天然牛至油、山苍子油、百里香酚、合成肉桂醛及智特奇植物精油产品“智然香”等9种植物精油对肠道致病菌产气荚膜梭菌的抑菌作用，比较其与硫酸粘杆菌素的抑菌效果，旨在研究一种对致病厌氧菌具有良好抑菌作用的精油抗菌剂。

1 试验设计与方法

1.1 试验材料

市场上出售的不同厂家生产的香芹酚、天然肉桂醛、丁香酚、合成牛至油、天然牛至油、山苍子油、百里香酚、合成肉桂醛、广州智特奇生物科技股份有限公司的植物精油产品“智然香”以及硫酸粘杆菌素。产气荚膜梭菌购自广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 试验仪器

厌氧培养箱；恒温恒湿培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ-IG型单人净化工作台，苏州净化设备有限公司；DHG-924OA电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；不锈钢手提式蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；FA2004电子天平(感量0.0001g)，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；酒精灯、培养皿、试管、移液枪、接种环等。

1.3 培养基

胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖 5g，氯化钠 5g，酵母膏3g，乙酸钠 3g，可溶性淀粉 1g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g，加入900mL水溶解，搅拌均匀，用0.1mol/mL的NaOH溶液把pH调至6.8，再加入蒸馏水至 1000mL，121℃灭菌 20min，冷却待用。

1.4 培养基的处理

将各植物精油与吐温-80按体积比1:3配制，加水稀释配制成10%的植物精油溶液，在厌氧培养箱内将各植物精油溶液与硫酸粘杆菌素加入到灭菌好的培养皿，设置不同的浓度梯度，然后将灭菌后冷却至60℃左右的培养基倒入培养皿，平皿内溶液终体积为5mL，混合均匀，冷却凝固。

1.5 菌悬液的配制

在厌氧环境中，从经过活化的菌平板中挑取一定量的菌落至灭菌生理盐水中，混合均匀，配成菌悬液，4℃保存待用。

1.6 菌液接种

分别在对应的平皿加入25μL产气荚膜梭菌，利用涂布棒将菌液涂布均匀，放入厌氧培养袋中，充入氮气，封好口，放入培养箱37℃培养48h，观察菌体的生长情况，细菌生长完全被抑制时所对应最低药物浓度即为MIC。

2 数据与分析

不同植物精油对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度如下表所示。由表可知，与硫酸黏杆菌素相比，各植物精油对产气荚膜梭菌均有较好的抑菌效果。9种精油对产气荚膜梭菌的抑菌效果由强到弱排序为：合成肉桂醛（0.004%）＞香芹酚（0.02%）=百里香酚（0.02%）=天然肉桂醛（0.02%）=智然香（0.02%）＞合成牛至油（0.05%）＞丁香酚（0.07%）＞天然牛至油（0.08%）＞山苍子油（0.11%）。

表1 不同植物精油对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度

3 讨论

植物精油主要来自植物的花、叶、根、树皮、果实、种子和树脂等，一般含有酚类、醇类、醛类、酮类和萜烯类化合物等主要成分。酚类、醇类、醛类、酮类和萜烯类化合物有一定的抑菌作用，其作用机理可能为：第一，多数植物精油的主要成分是酚类及萜类化合物，萜类化合物有着较强的抗菌作用，其能使细菌细胞壁的结构蛋白变性和凝聚，改变H+和K+的渗透性，会使细胞内外物质交换失去平衡，细胞内容物渗漏，最终导致细菌死亡（蔡一鸣等，1995；林清华等，1997）；第二，会改变线粒体膜的通透性，阻止线粒体的呼吸氧化过程，使病原微生物因缺乏能量供应而死亡（陈权军等，2004）；第三，进入病原体的核糖体、内质网和高尔基体，进而影响膜的通透性，使蛋白质、酶的合成和转换受阻，从而影响病原微生物的生长（杨频等，2004）；第四，直接影响脂质层的稳定性，溶解病原微生物的脂肪体，甚至会降低细胞膜脂质层的相变温度，进而影响脂膜的流动性（Martin等，1988）。研究表明在植物精油中，百里香酚和肉桂醛属于抑菌活性最强的成分，二者均能作用于细菌细胞膜上的靶点。王改琴等（2014）采用琼脂平板孔洞法分别对不同来源的肉桂醛、香芹酚等植物精油及其混合物进行体外抑菌效果筛选和评估，结果表明肉桂醛的抑菌效果最好。李文茹等（2013）研究了肉桂、山苍子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜精油等6种典型植物精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，结果表明肉桂的抑菌效果最好。Macheboeuf等（2008）结果表明，肉桂醛是醛类挥发油中抑菌效果最好的活性物质。

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，为厌氧性的革兰阳性菌，在某些条件下，可能成为人兽共患病病原菌，导致坏死性肠炎、肠毒血症和创伤性气性坏疽等疾病。目前，防治产气荚膜梭菌引起的疾病主要是使用抗生素及化学合成药物，然而大量使用抗生素导致耐药性菌株不断出现，以致疾病难以控制，同时长期使用这类药物会污染自然环境、伤害机体、降低免疫力。所以，人们在不断寻找抗生素和化学药物的替代品。植物精油属天然产物，有低残留、低毒副作用、无污染等特点，其杀菌、保健等功能越来越引起人们的关注，从中筛选出抗生素及化学合成药的新型替代物是解决抗生素滥用问题的有效途径之一。研究发现，在仔猪（LiSY等，2012）和鸡（Jamroz等，2005）饲粮中添加适宜水平的百里香酚和肉桂醛等提高了肠道乳酸杆菌的数量，降低了大肠杆菌数量；牛至和大蒜精油降低了肉鸡肠道梭状芽孢杆菌和链球菌数量（Kirkpinar等，2011）。以上结果表明，植物精油能抑制有害菌生长，改善肠道菌群平衡，从而保证其消化吸收能力的发挥。Ouwehand等（2010）报道，致病性的大肠杆菌、产气夹膜梭菌和沙门氏菌可被牛至精油、迷迭香精油、百里香精油以及香芹酚、百里香酚、肉桂醛、柠檬醛和柠檬烯等单品所抑制。杜恩存（2016）采用肉汤法通过体外试验研究了百里香酚和香芹酚对产气荚膜梭菌的抑菌效果，发现百里香酚和香芹酚对产气荚膜梭菌具有相同的抑菌效果，MIC均为 375μg/mL。韩乾杰等（2017）采用牛津杯法，测定肉桂醛、百里香酚和香兰素对于4种细菌（大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、乳酸菌）的抑菌效果，结果表明3种植物精油均对大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌有明显抑制作用，但对乳酸菌无抑制作用，在相同浓度下，抑菌效果为肉桂醛＞香兰素＞百里香酚。张皓然等（2018）研究了植物精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑菌效果，结果表明植物精油中肉桂醛的抑菌作用优于百里香酚和香兰素。

本试验用琼脂平板法研究了香芹酚、天然肉桂醛、丁香酚、合成牛至油、天然牛至油、山苍子油、百里香酚、合成肉桂醛、智特奇植物精油产品智然香等9种植物精油对产气荚膜梭菌的抑菌效果，结果发现9种精油均对产气荚膜梭菌有较好的抑菌效果，且不同植物精油的抑菌效果不同，其中合成肉桂醛对产气荚膜梭菌的抑菌效果最好，MIC为0.004%，抑菌效果明显优于其他精油。对于常见的植物精油组分百里香酚和香芹酚，有研究发现其对产气荚膜梭菌的MIC分别为0.24mg/mL和0.30mg/mL（杜恩存，2016），本试验中百里香酚和香芹酚对产气荚膜梭菌的MIC均为0.02%，百里香酚的MIC与前人研究相符合，香芹酚的MIC优于前人的研究结果。从本试验结果也发现合成的植物精油效果好于天然的植物精油，另外智特奇植物精油产品智然香对产气荚膜梭菌有较好的抑菌效果，其MIC为0.02%，抑菌效果好于牛至油、丁香酚和山苍子油。

4 结论

9种植物精油对产气荚膜梭菌有较好的抑菌效果，抑菌效果均好于硫酸粘杆菌，合成肉桂醛的抑菌效果最好，其次是百里香酚、天然肉桂醛、香芹酚及智然香，合成牛至油、天然牛至油、丁香酚对产气荚膜梭菌的最低抑菌浓度相对较高，而山苍子油的抑菌效果最差。