复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙

黄 翔，陶 蕾，杨 燃，黄 群,*，安凤平，黄 茜，马美湖

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350002；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070）

我国是世界禽蛋生产和消费第一大国，每年废弃的鸡蛋壳约300万 t[1]，造成严重的环境污染和资源浪费。蛋壳钙是一种理想的膳食钙源，提自蛋壳粉的钙比商业碳酸钙在大鼠小肠中更易吸收[2]。蛋壳钙可用于人体和动物骨矿化和生长的缺钙治疗[3]，以及作为牙膏的抗牙垢剂[4]。食品工业利用蛋壳钙制备的乳酸钙作为固化剂、调味剂、膨松剂及抗菌剂[5]。

乳酸钙、柠檬酸钙和葡萄糖酸钙等有机酸钙制剂的高效制备为当前研究热点[6]。乳酸钙是补充和强化骨骼钙的理想添加剂，广泛用于医药、食品和饲料工业[7]。蛋壳含有丰富的碳酸钙，可作为钙源制备有机酸钙，目前主要方法有高温煅烧法、直接中和法与微生物发酵法[8]。高温煅烧法和直接中和法能耗大，钙转化率较低，工业化生产成本高。微生物发酵法耗能低、不易对环境产生污染、制备工艺条件简单，更适于制备乳酸钙[9]。

微生物发酵转化蛋壳钙为乳酸钙的常用微生物为乳酸菌，乳酸菌能利用糖类发酵产生乳酸[10]。复合乳酸菌可以利用不同乳酸菌的生理生化特点，互为对方提供适宜的生长环境，并达到代谢产物的互补。已有研究[11-12]使用复合菌种发酵苹果山药果蔬汁，发现复合菌种发酵最终产酸量和产品品质明显要优于单一菌株，发酵能力和抑菌效果也优于单株乳酸菌。利用4 种乳酸菌复合发酵蛋壳制备乳酸钙的研究鲜见报道，本研究选取乳酸产量相对较高的蒙氏肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌4 种乳酸菌复合发酵蛋壳生物制备乳酸钙，利用响应面法对发酵工艺进行优化，以提高转化效益与乳酸钙产量，为后续乳酸菌发酵法回收利用废弃蛋壳制备乳酸钙提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋壳收集于福建农林大学蛋糕店。蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）为华中农业大学蛋品加工国家地方工程实验室贮藏，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，保藏编号CICC 20382）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，保藏编号CICC 20282）购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

MRS（Man Rogosa Sharpe）、MRS琼脂培养基 青岛海博生物技术有限公司；钙黄绿素（分析纯） 上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YF-150B中药材粉碎机 瑞安市永历制药机械有限公司；TGL-16冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司；GI65DS高压蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司；GHP-9160隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；ZWYR-240恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限公司；AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪 美国尼高力仪器公司；DY5261型X射线多晶衍射仪 美国CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋壳粉制备

蒸馏水清洗后的蛋壳于70 ℃电热恒温干燥箱中干燥3 h，随后放入连续式高性能粉碎机中粉碎。将蛋壳粉加入蒸馏水浸泡，搅拌10 min后静置15 min，除去上液漂浮的蛋壳膜。蛋壳粉抽滤后在70 ℃干燥3 h，过200 目筛后收集备用。

1.3.2 培养基与菌种活化

发酵培养基：蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母提取物1.0 g，盐溶液（NaHCO310.0 g、NaCl 2.0 g、无水CaCl20.2 g，K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.48 g，定容至1 000 mL）4 mL，葡萄糖12 g，蛋壳粉8 g，蒸馏水100 mL。培养基成分充分混均后，121 ℃灭菌20 min，蛋壳粉单独灭菌，冷却后备用。

菌种活化：4 株菌种（蒙氏肠球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌）分别接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养24 h，2.0%的接种量传代2～3 次，直至恢复活力，0～4 ℃冰箱中低温保藏。

1.3.3 理化指标测定

发酵液乳酸钙含量测定：采用文献[1 3]的方法；发酵液残糖量测定：采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[14]；乳酸钙纯度测定：参照参考文献[15]的方法。

1.3.4 拮抗实验

将4 种菌两两交叉划线接种于MRS琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，观察十字交叉处是否有被抑制而发生菌落萎缩和消失的现象[10]。

1.3.5 乳酸菌生长曲线绘制

将活化后的4 种乳酸菌按体积分数2.0%分别接种于MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养。前12 h每隔1 h测定一次，后12 h每隔3 h测定一次，菌液稀释10 倍后测600 nm波长处OD值，连续测定至48 h。MRS液体培养基为空白对照，绘制乳酸菌生长曲线。

1.3.6 发酵工艺优化

1.3.6.1 复合菌种不同组合对乳酸钙产量的影响

4 种乳酸菌按不同比例相互组合。将各菌液浓度统一调成1×108CFU/mL，发酵培养基中依次接入蒙氏肠球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌，接种体积比为1∶1∶1∶1、1∶2∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶1∶1∶2、2∶1∶1∶1等15 种组合。于37 ℃、180 r/min厌氧发酵72 h，研究4 种菌不同组合发酵对乳酸钙产量的影响。

1.3.6.2 单因素试验

发酵温度的选择：培养基pH值为7.0，接种量为8.0%，分别在32、34、37、39、42 ℃，180 r/min厌氧发酵72 h，考察发酵温度对乳酸钙产量的影响。

发酵时间的选择：培养基pH值为7.0，接种量为8.0%，于37 ℃、180 r/min条件下厌氧发酵48、54、60、72、80 h，考察发酵时间对乳酸钙产量的影响。

初始pH值的选择：调整培养基pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在接种量为8.0%的条件下，37 ℃、180 r/min厌氧发酵60 h，考察培养基pH值对乳酸钙产量的影响。

接种量的选择：向发酵培养基中依次接入蒙氏肠球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌，设定各个菌株的接种量分别为2%、3%、4%、5%、6%，则复合菌总接种量分别为8.0%、12.0%、16.0%、20.0%、24.0%，接入到发酵培养基中，37 ℃、180 r/min厌氧发酵60 h，考察不同菌液接种量对乳酸钙产量的影响。

不同金属离子及其质量浓度的选择：将MnSO4·H2O、ZnSO4·H2O、MgSO4·7H2O分别配制成质量浓度0.01、0.1、1.0 g/L的金属离子溶液，分别将不同浓度的Mn2＋、Zn2＋、Mg2＋金属离子溶液添加到发酵培养基中。在培养基pH 7.0、接种量8.0%的条件下，37 ℃、180 r/min厌氧发酵60 h，考察不同金属离子及其质量浓度对乳酸钙产量的影响。

1.3.6.3 响应面试验设计

综合考虑单因素试验结果，选取对乳酸钙产量影响显著的3 个因素发酵时间、初始pH值、接种量为考察变量，乳酸钙产量为响应值，通过响应面分析优化发酵条件。应用Design-Expert 10.0.7软件设计3因素3水平响应面分析试验，试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of independent variables used for response surface design

1.3.7 发酵液中乳酸钙的提取

发酵液含有发酵产物乳酸钙、过剩蛋壳钙、未发酵残糖、色素、蛋白质等[16]，需对发酵液进行除杂处理。发酵液离心后取上清液，加入氢氧化钙调pH值至12～13，80 ℃搅拌30 min。将粗乳酸钙液过滤，pH值调至4～5，加入3.0%～4.0%的粉末活性炭以吸附色素等杂质，50～60 ℃静置2 h，真空抽滤滤去活性炭，重复脱色直至澄清。收集乳酸钙母液旋转蒸发浓缩后，低温冷却结晶，再将晶体溶于蒸馏水中进行重结晶。加入适量无水乙醇，洗涤乳酸钙晶体，除去残余的乳酸及表面附着的其它残留物。将乳酸钙产物于80 ℃干燥8 h，达到质量恒定即可粉碎、过筛得乳酸钙成品[15]。

1.3.8 产物结构表征

1.3.8.1 傅里叶变换红外光谱分析

将乳酸钙样品和溴化钾粉末于120 ℃干燥4 h，干燥器中冷却30 min。分别取乳酸钙样品和溴化钾粉末以1∶100的比例置于玛瑙研钵中充分混合，研磨精细。研磨混匀的粉末加入制样模具中压成几乎呈透明的圆片后进行红外光谱分析。测定条件：光谱范围4 000～400 cm-1；峰-峰值的噪声为1.3×10-5Abs/min扫描；RMS噪声为3.6×10-6Abs/min扫描。

1.3.8.2 X射线衍射分析

将乳酸钙样品充分干燥后用玛瑙研钵尽可能研细，然后把试样粉末均匀撒入制样框的窗口中，用玻璃片轻压制成1.5～2.0 mm足够紧密的平整平面，将乳酸钙制样框放入试样台进行X射线衍射分析。测定条件：电压220 V，频率50 Hz，连续扫描，管电流20 mA，管电压10～40 kV，初始角度10°，终止角度80°。

1.4 数据处理

每组实验重复3 次，采用SPSS 24.0统计软件对数据进行单因素方差分析ANOVA及显著性差异分析，结果以±s表示。利用Origin 2017软件绘图，选用Design-Expert 10.0.7 软件进行响应面分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 拮抗实验结果

图1 4 种菌的拮抗实验结果Fig. 1 Antagonistic effects among four strains

如图1所示，平板上4 种菌均生长良好，两两交叉处无菌落萎缩或消失现象，说明4 种菌之间没有拮抗作用，可以用于混菌复合发酵实验。

2.2 乳酸菌生长曲线

图2 乳酸菌生长曲线Fig. 2 Growth curves of lactic acid bacteria

由图2可知，4 种乳酸菌的延滞期较短，在接种后0～4 h开始缓慢生长，该时期内细胞繁殖较慢，数量增长较少。菌体经过较短的延迟期后进入对数生长期，在4～10 h内生长迅速，呈指数级增长，菌种代谢和繁殖加快，酶系活跃，代谢旺盛，培养基内菌株生长速率达到最大。到12 h时总菌数达到较高水平并基本保持不变，进入稳定期，菌体生长速率变化幅度趋于平稳，活菌数保持相对稳定，菌落代谢产物不断积累达到最高峰。到20 h后进入衰亡期，活菌菌体数量逐渐缓慢减少，菌种活性降低并趋于停滞。

根据4 种菌株的生长曲线综合判断，菌株接种后12 h活性较高，在12 h时各菌液的OD值均达到较大值，适合下一代的接种[17-18]。此后保持相对稳定，说明菌液在12 h时生长状况最佳，故本实验中4 种乳酸菌均选取培养12 h的稳定期菌液进行接种发酵。

2.3 复合菌株组合对乳酸钙产量的影响

图3 复合菌株组合对乳酸钙产量的影响Fig. 3 Effects of different mixed starter cultures on the yield of calcium lactate

依次按照蒙氏肠球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌的顺序接种。由图3可知，复合菌种接种量比为1∶1∶2∶1时，乳酸钙产量最高。对结果进行的差异显著性分析表明，接种比为1∶1∶2∶1与1∶2∶2∶1、2∶1∶1∶1无显著差异（P＞0.05），与其他12 组均有显著差异。有研究报道，嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌以1∶1接种的发酵活力最佳[19]。乳酸杆菌属的干酪乳杆菌是乳酸生产的重要来源，这可能是将干酪乳杆菌与嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌混合后对其他乳酸菌起到了互相促进生长的作用[20]，达到理想的发酵效果。因此复合菌株接种量比选定为1∶1∶2∶1。

2.4 单因素试验结果

图4 单因素对乳酸钙产量的影响Fig. 4 Effects of fi ve fermentation parameters on calcium lactate yield investigated by one-factor-at-a-time method

由图4a可知，随着发酵温度的升高，乳酸钙产量先升高后下降，发酵温度对乳酸钙产量影响显著。37 ℃时乳酸钙产量达最大值，残糖量最低，说明复合乳酸菌利用葡萄糖的效果最好。当培养温度低于37 ℃时，温度过低，酶活性受抑制，酶促反应减弱，导致菌体生长和代谢减缓。但温度过高时，会导致菌体蛋白质凝固变性，核酸降解变性失活[21]，故高于37 ℃后乳酸钙产量降低。复合乳酸菌的适宜发酵温度为37 ℃。

由图4b可知，随着发酵时间的延长，乳酸钙产量逐渐升高，葡萄糖含量逐渐降低。发酵时间对乳酸钙产量和残糖量有显著影响。当发酵时间超过60 h后，乳酸钙产量增长缓慢且趋于停止。这是因为在60 h之前随着培养时间的延长，乳酸菌数量不断增加，利用葡萄糖发酵产生的乳酸含量也逐渐增多，葡萄糖作为乳酸菌生长发酵的碳源，生成大量的乳酸钙。60 h后葡萄糖等营养物质含量减少，减缓了乳酸菌的生长和代谢[22]，导致乳酸钙的产量减少。发酵时间以60～72 h为宜。

由图4c可知，随着培养基初始pH值的升高，乳酸钙产量呈现先升高后降低的变化特征。初始pH值对乳酸钙产量有显著影响。当pH值较低时，由于大量氢离子的存在，超过了乳酸菌保持胞内pH值动态平衡的能力，导致膜脂饱和度下降，胞内pH值也随之下降，从而抑制了乳酸菌的生长。培养基pH值控制在6.0时，乳酸菌生长较好，乳酸产量最高，这与乳酸菌生长的最适pH值一致[23]。当pH值超过6.5后，pH值升高使原来培养基中离子间的化学平衡发生移动、生成沉淀，降低了培养基的有效成份，也抑制了乳酸菌的代谢生长。发酵培养基pH值以6.0为宜。

由图4d可知，随着接种量的增加，乳酸钙产量逐渐降低。这是因为接种量过多时，菌体生长过快，微生物对营养物质的竞争增强，培养液黏度增加，加速细胞衰老，导致部分菌体死亡，并且产生过多代谢废物，葡萄糖利用降低，发酵后劲不足，从而影响代谢产物的合成，产酸量随之下降[24]。发酵接种量以8.0%为宜。

由图4e可知，低浓度Mn2＋与Mg2＋一定程度上可提高乳酸钙产量，最佳质量浓度均为0.1 g/L；而高质量浓度会表现出一定的抑制作用。二价金属离子Mn2＋、Mg2＋是激活金属酶的必要辅因子，糖酵解途径的大多数酶都需要Mg2＋的参与，Mg2＋含量与正常细胞的增殖直接相关；Mg2＋是葡萄糖激酶、磷酸烯醇化酶、丙酮酸酶等主要酶的激活剂和复合酶的中心组成部分，但作用浓度较低[25]。Mn2＋是乳酸脱氢酶的组成部分，也是某些磷酸转移酶的辅因子，对细胞生长速度和生物量浓度具有重要的有益影响，可促进乳酸生成[26]。Guo Yuxing等[27]研究发现Mn2＋、Mg2＋和Ca2＋可以显著增强乳酸菌蛋白酶活力，而Co2＋、Zn2＋、Ni2＋和EDTA则会抑制该酶活性；与本研究结果一致，但对提高乳酸钙产量的效果不显著。

2.5 响应面试验结果

2.5.1 响应面回归模型的建立与分析

以发酵时间、初始pH值和接种量为试验因素，基于Box-Behnken试验设计，以乳酸钙产量为响应值，进行二次多项回归方程拟合及分析。试验设计及结果如表2所示。

对试验数据进行多项式拟合回归，得二次多元回归方程：Y=20.47-1.09A＋1.48B-0.42C＋1.68AB-0.051AC-2.56BC＋6.07A2＋5.03B2＋6.35C2。

为进一步分析回归方程的拟合度，对模型进行ANOVA方差分析，结果如表3所示。拟合方程的P值小于0.000 1，表明响应回归模型达到了极显著水平。失拟项P=0.051 0＞0.05，失拟不显著，说明方程的拟合程度较好，回归方程可以准确分析和预测各因素与乳酸钙产量之间的关系。模型的确定系数R2为0.988 3，说明该模型能解释98.83%响应值的变化，因而该模型拟合程度较好，能很好地反映响应值的变化，可以利用此模型对乳酸钙产量进行分析和预测。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design with results for response surface analysis

表3 回归模型和方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由回归模型和方差分析可知，方程一次项B，交互项BC和二次项A2、B2、C2对乳酸钙产量的影响达到极显著水平；方程一次项A、交互项AB影响达到显著水平。根据F值可知，各因素对乳酸钙产量影响的大小顺序为：初始pH值（B）＞发酵时间（A）＞接种量（C）。

2.5.2 响应面分析与优化

根据回归拟合方程，每2 个因素对乳酸钙产量作响应面和二维等高线图（图5）。通过观察响应面的变化情况和等高线的稀疏程度可直观地反映因素之间交互作用对乳酸钙产量的影响，当图形呈椭圆形或马鞍形时，表示两因素交互作用显著[28]。分析可知，发酵液pH值（B）和接种量（C）的交互作用对乳酸钙产量的影响最为明显。初始pH值对乳酸钙产量影响的等高线较密集，说明发酵液初始pH值的影响更为显著，与模型方差分析得出的结论一致。

图5 各因素交互作用对乳酸钙产量的影响Fig. 5 Interactive effects of variables on calcium lactate yield

2.5.3 最佳条件的预测及验证

通过回归模型的预测，响应值（Y）最大值时各因子水平为A=1、B=1、C=-1。对应的复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙最佳工艺条件为发酵温度37 ℃、发酵时间72 h、发酵液pH 6.5、复合菌接种量8.0%，在此条件下预测乳酸钙产量为42.030 g/L。为验证模型预测的准确性，依据响应面试验优化得到的发酵条件，3 次平行实验进行验证，在此条件下，乳酸钙产量达（40.01±0.035）g/L，高于陈文洁等[17]报道的27.28 g/L，与模型预测值相差4.8%，与理论值基本相符，说明采用此模型优化得到的参数准确可靠。测得所制备的乳酸钙纯度为92.65%，高于李逢振等[29]报道的86.92%。

2.6 产品结构表征

2.6.1 傅里叶变换红外光谱

图6 蛋壳源乳酸钙产品（A）及其红外光谱图（B）Fig. 6 Visual appearance (A) and infrared spectrum (B) of calcium lactate from eggshell

如图6所示，蛋壳源乳酸钙呈白色或乳白色晶体粉末；与蛋壳粉的红外光谱对比可知，蛋壳钙经发酵已转化为乳酸钙。在3 500～3 200 cm-1出现了一个较宽且强的吸收峰，为游离O—H的弯曲振动；浓度较高的乳酸钙试样中，羟基化学物产生缔合现象，O—H的伸缩振动吸收峰稍微向低波数方向位移所形成的，峰尖约在3 350 cm-1左右。在3 000～2 800 cm-1范围内出现一个小而尖的峰，这是典型的—CH3、C—H伸缩振动导致的吸收峰。而本应在1 900～1 650 cm-1范围内出现的C＝O伸缩振动的吸收峰由于结合了Ca2＋，向低波数1 600～1 500 cm-1范围内发生了偏移。在1 350～1 450 cm-1出现的细尖峰为C—H的弯曲振动；红外光谱在1 300～4 000 cm-1为官能团区，小于1 300 cm-1为非官能团区，反映的是分子结构变化，如C—C的伸缩振动[30]。通过对产物乳酸钙的红外光谱分析，证实复合乳酸菌发酵蛋壳钙制备所得产物为乳酸钙。

2.6.2 X射线衍射

图7 蛋壳乳酸钙X-射线衍射Fig. 7 X-ray diffraction patterns of calcium lactate from eggshell

如图7所示，蛋壳乳酸钙的衍射峰尖锐清晰，说明乳酸钙结晶程度较高[31]。将样品的X-射线衍射图谱与JCPDS标准物质卡片05-0101中不同角度位置（2θ）的乳酸钙数据对比进行物相鉴定[32]，发现在乳酸钙主要特征衍射峰位置（2θ为8.0°、22.1°、27.4°、45.2°等）左右均出峰，特征峰位置和标准谱图在相同角度两图谱出现衍射峰相似，说明晶体及空间结构相似，再次验证发酵产物为乳酸钙[33]。

3 结 论

利用鸡蛋壳为天然绿色钙源通过生物发酵转化制备乳酸钙，采用复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙，单因素试验研究了发酵温度、初始pH值、接种量等因素对乳酸钙产量的影响；在此基础上根据Box-Behnken试验设计和响应面分析对发酵条件进行优化。结果表明，复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙的最佳工艺条件为：发酵温度37 ℃、发酵时间72 h、初始pH 6.5、复合菌接种量8.0%，在此条件下，乳酸钙产量达（40.01±0.035）g/L，纯度为92.65%。通过傅里叶变换红外光谱、X-射线衍射表征了乳酸钙的结构，证实发酵得到的产物即为乳酸钙。此研究为进一步利用微生物发酵蛋壳制备乳酸钙的开发利用提供了理论依据，且为鸡蛋壳的综合利用开辟了可行、有效途径。