高效液相色谱-荧光检测法测定发酵红肉制品中Neu5Gc

晏印雪， 朱秋劲*，2， 梁美莲， 周樱子， 常 瑞，李洪英， 徐阿奇， 刘春丽， 曾雪峰，2

（1.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳550025；2.贵州省农畜产品贮藏与加工重点实验室，贵州 贵阳550025）

红肉一般指红色肌肉纤维比白色肌肉纤维多的动物肉。2015年10月26日，国际癌症研究机构将红肉列为 “可能对人类致癌”（2A类）致癌物质[1-3]。

红肉中非人类唾液酸Neu5Gc被报道为特有的致癌物质，外源性的Neu5Gc主要通过摄食红肉制品而在人体富集，继而机体产生抗Neu5Gc抗体，从而促发炎症和增加致癌风险[4]。Neu5Gc是唾液酸（Sialic acid，Sia）的一种，唾液酸又叫酰化神经氨酸，是一类具有9碳骨架的酸性糖类。大多数哺乳动物包括与人类相近的类人猿都可以自身合成Neu5Gc，但人类由于缺失可将CMP-Neu5Ac转化为CMP-Neu5Gc的CMAH羟化酶，所以健康的人体不能合成[4-6]。Neu5Gc通过代谢进入人体组织，含Neu5Gc的糖基复合物能够被Hanganutziu-Deicher（H-D）抗体特异性识别[7]。因此，Neu5Gc已成为食品安全检测与肿瘤诊断的新靶标，同时红肉及红肉加工制品中的Neu5Gc日益备受关注[8-13]。目前发酵红肉及制品主要研究微生物发酵降解胆固醇、杂环胺、亚硝酸盐以及其抗氧化性的特性[14-17]，而对于红肉中特异性风险物质Neu5Gc研究鲜见报道。

迄今，对于唾液酸的检测方法常用的有：基于比色法的间苯二酚法、硫代己比妥酸 （2-Thiobarbituric acid，TBA）法；基于色谱法的高效液相色谱法 （RP-HPLC）、荧光高效液相色谱法（HPLC-FLD）等，传统的分光光度法只能检测总的唾液酸含量，有效检测Neu5Gc含量的方法有高效液相色谱法、HPLC-FLD和液相色谱-质谱法 （LCMS/MS）等，但主要针对在生鲜红肉[2，18-19]、动物内脏[18，20]、乳及乳制品[12，21-23]中 Neu5Gc 的含量，目前关于红肉在发酵环节和发酵制品中Neu5Gc含量测定未见报道。搭建发酵红肉及制品中Neu5Gc的检测方法对考察红肉发酵过程与Neu5Gc的消长规律具有重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷鲜猪肉、宣威火腿、广式香肠、川味香肠、美式火腿：购于贵阳市花溪区合力超市；传统土家特色酸鲊肉、接种发酵酸鲊肉：均为实验室自制。

Neu5Gc 标准品 （GC，≥99%）、DMB （GC，≥99%）、β-巯基乙醇（色谱纯）：Sigma公司产品；甲醇（色谱纯）：德国applichem公司产品。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪 （配有荧光检测器和自动进样器）：美国安捷伦科技有限公司产品；LiChrosorb RP-18 色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）：默克集团产品；ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）、ZORBAX 300Extend-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）：美国安捷伦科技有限公司产品；CTFD-12S冷冻干燥机：青岛永合创信电子科技有限公司产品；S825-12DT超声清洗器：上海冠特超声仪器有限公司产品；DY89-II电动玻璃匀浆机：上海安亭科学仪器厂产品；AR224CN电子分析天平：奥豪斯仪器（贵州）有限公司产品；TG16-WS高速冷冻离心机：上海卢湘仪仪器有限公司产品；XMTD203数显恒温油浴锅：江苏科析仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 Neu5Gc标准溶液配制 精确称量0.0825 g Neu5Gc标准品，用超纯水溶解于烧杯中，随后转移至250 mL容量瓶中，定容至刻度，即为1 mmol/L Neu5Gc标准品溶液。吸取1 mmol/L Neu5Gc标准品溶液配制成 10、25、50、100、200、300、400 μmol/L 等一系列浓度梯度的Neu5Gc标准溶液，待衍生。

1.3.2 样品溶液制备 取发酵红肉制品（我国传统酸鲊肉、发酵香肠、火腿等），根据发酵红肉制品的原料形状不同，分为块状及肉糜状发酵红肉制品。

1）肉糜状发酵红肉制品：剥去肠衣，精确称取1 g肉糜，用10 mL质量分数30%的饱和硫酸铵溶液匀浆以沉淀蛋白，并冷冻干燥去除硫酸铵。为使Neu5Gc游离出来，将冻干后的样品加入10 mL质量分数2 mol/L冰乙酸于80℃水浴锅中水解3 h，以12000 r/min的转速离心10 min取上清液，用0.45 μm膜过滤后进行二次冻干除去冰乙酸。冻干粉溶解于1 mL 0.1 mol/L的NaOH中，37℃水浴30 min，用 0.45 μm 膜过滤制得样品溶液，待衍生[24]。

2）块状发酵红肉制品：选取块状发酵红肉制品的精瘦肉部分，取1 cm以下的中间肉样1 g，制备方法同上。

1.3.3 DMB衍生剂溶液的配制及衍生反应 参考Martín 等[25]介绍的方法配制 8 mmol/L DMB、1.5 mol/L冰乙酸、0.25 mol/L硫代硫酸钠、0.25 mol/L亚硫酸钠、0.8 mmol/L β-巯基乙醇。

准确吸取900 μL的样品溶液或Neu5Gc标准溶液，加入100 μL DMB衍生试剂，于水浴锅中50℃避光衍生2.5 h后放入冰水混合液中快速冷却，用0.22 μm膜过滤后待测。

1.3.4 高效液相色谱条件的选择优化 采用默克LiChrosorb RP-18 色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）、安捷伦ZORBAX 300Extend-C18色谱柱 （150 mm×4.6 mm×5 μm）和安捷伦 ZORBAX Eclipse XDBC18 色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），荧光检测器激发波长373 nm、发射波长448 nm，柱温30℃，流量为0.9 mL/min，进样体积10 μL。以甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水为流动相，优化流动相配比。

2 结果与分析

2.1 色谱柱及流动相的确定

根据已报道的色谱条件[19，24]进行预实验，试验结果表明：现有的Neu5Gc检测方法只适用于鲜肉、牛奶、鸡蛋等未经发酵的食品中的Neu5Gc浓度检测，而不适用于发酵红肉制品中Neu5Gc浓度检测。如图1所示，经微生物发酵后的肉制品，因微生物发酵分解有机物，并产生代谢产物，在流动相为V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）=8∶7∶85 条件下，发酵红肉样品的目标峰的峰形不对称并向左偏移，加标后目标峰的峰形向Neu5Gc标准品保留时间方向偏移，由此可知在Neu5Gc目标峰出峰时间内有杂质干扰，无法对发酵红肉制品中Neu5Gc的浓度进行测定。

图 1 流动相为 V（甲醇）∶V（乙腈）∶V（水）=8∶7∶85 的 HPCL色谱图Fig.1 HPCL chromatogram of methanol-acetonitrilewater（8：7：85，V/V）

随后分别选择默克LiChrosorb RP-18色谱柱（150 mm ×4.6 mm ×5 μm）、 安 捷 伦 ZORBAX 300Extend-C18 色谱柱 （150 mm×4.6 mm×5 μm）和安捷伦 ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm），以甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等流动相体系的不同体积配比，对样品的液相色谱检测条件进行优化。

通过不同色谱柱分离效果对比，发现使用安捷伦 ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm×5 μm）分离效果最佳。通过初步流动相体系筛选，选用甲醇-水作为流动相体系，并对不同流动相体积分数配比进行优化，结果如图2所示。实验表明：当流动相A为超纯水，B为甲醇溶液，体积比为80∶20洗脱，能使Neu5Gc杂质的峰与主成分峰分离有效分离（分离度R＞1.5），如图3所示；且峰形良好，Neu5Gc的保留时间为14.484 min，如图4所示。并且采用梯度洗脱能显著降低检测时间，提高检测效率，梯度洗脱程序如表1所示。

图2 不同流动相比例HPLC色谱图Fig.2 HPCL chromatogram of different mobile phase ratio

图3 传统发酵30 d酸鲊肉样品中Neu5Gc的HPLC色谱图Fig.3 HPCL chromatogram of Neu5Gc in traditional fermented 30-day Suanzharou

图4 Neu5Gc标准样品HPCL色谱图Fig.4 HPCL chromatogram of Neu5GC standard

表1 流动相梯度洗脱条件Table1 Conditions for mobile phase by gradient elution

2.2 标准曲线的绘制

取 10、25、50、100、200、300、400 μmol/L 等一系列浓度梯度的Neu5Gc标准溶液，衍生后进样检测，不同浓度标准品溶液平行测定3次。以标准品浓度为横坐标，对应的色谱峰面积的平均值为纵坐标，绘制线性标准曲线，如图5所示。结果表明，在10～400 μmol/L线性范围内，Neu5Gc峰面积与浓度呈现良好的线性关系，符合测定要求。

图5 Neu5Gc标准曲线Fig.5 Neu5Gc standard curve

2.3 检出限、定量限

取1 mmol/L Neu5Gc标准品溶液倍数稀释后衍生测定。实验结果表明：RSN=3时，最低检出限（LOD）为 0.001 μmol/L，高于 LC-MS/MS 测定 Neu5Gc的最低检测限 0.3 μmol/L[13]；RSN=10 时，定量限（LOQ）为 0.003 μmol/L。

2.4 重复性、精密度

取同一发酵肉样，按照1.3.2样品溶液制备方法制备平行样品溶液5份，衍生后，依次进样检测。5份样品Neu5Gc浓度的RSD值为1.5%；取同一待测样品溶液连续进样6次，测得Neu5Gc峰面积的RSD为1.2%。结果显示，本实验方法具有良好的精密度和重现性。

2.5 Neu5Gc加标回收率测定

取3份已知Neu5Gc浓度样品，分别加入1、5、10 μmol/mL 3个浓度的Neu5Gc标准溶液进行加标回收实验，结果如表2所示，平均回收率在96.4%～99.07%之间。

表2 Neu5Gc加标回收率的测定Table2 Recovery of Neu5Gc in samples

2.6 样品检测结果

Varki等[25]检测得到生鲜猪肉中Neu5Gc质量分数为25.25 μg/g，而Chen等[20]测得生鲜猪肉中的Neu5Gc质量分数仅有5.6 μg/g。实验检测结果由图6可知，鲜肉原料 （S1）的Neu5Gc质量分数为（25.61±1.31）μg/g， 传统发酵 30 d 酸鲊肉 （S2）的Neu5Gc质量分数为 （17.14±0.92）μg/g， 接种发酵30天酸鲊肉 （S3） 的Neu5Gc质量分数为 （9.59±0.47） μg/g；Suna、Annie 等[18，26]分别测定了生长 3、38、180 d猪的新鲜猪肉、猪脾、猪腰、猪肺、猪心和猪肝和经过不同的加工方式加工的红肉制品中Neu5Gc质量分数，发现与猪肉相比，各个器官中Neu5Gc的质量分数较高，而不同的物理加工方式均显著改变了Neu5Gc质量分数以及Neu5Gc结合态与游离态的比例，其中有增加也有降低。对比鲜肉原料、传统发酵30 d酸鲊肉与接种发酵30 d酸鲊肉中的Neu5Gc质量分数可知，在发酵酸鲊肉与鲜肉原料之间Neu5Gc的质量分数存在显著性差异（p＜0.05），发酵可显著降低红肉中Neu5Gc的质量分数，且接种微生物发酵酸鲊肉中Neu5Gc质量分数最低；目前还没有微生物发酵降解Neu5Gc的研究，推测可能的原因：1）微生物发酵产生代谢产物，对Neu5Gc有降解作用，如乳酸等。蒋芸等[27]研究表明猪肉在添加乳酸的情况下，60.0%以上唾液酸被解离；2）Neu5Gc是一类具有9碳骨架的酸性糖类，通常附着于细胞表面和分泌的糖蛋白和糖脂的糖链的外端[4]，可能作为碳源被微生物利用进入代谢途径发生分解从而导致Neu5Gc在红肉中的质量分数降低。

图6 不同方式发酵的红肉制品中Neu5Gc的质量分数（n＝3）Fig.6 ContentofNeu5Gcinfermentedredmeat products by different ways（n＝3）

由图7和图8可知，肉糜状发酵肉制品中的Neu5Gc质量分数普遍低于块状发酵红肉制品中Neu5Gc质量分数，对两组样品（包括3个平行样）进行t检验分析得在置信区间95%内p值为0.03（＜0.05），即不同形态的红肉发酵制品中的Neu5Gc存在显著性差异。其中腊肉的Neu5Gc质量分数最高，萨拉米香肠质量分数最低。如果微生物发酵降解Neu5Gc质量分数的推测成立，据此推断肉糜状的红肉更有利于增大红肉与微生物的接触面积，从而使发酵更充分，提高Neu5Gc的降解效率。

图7 块状发酵红肉制品中Neu5G质量分数（n＝3）Fig.7 Content of Neu5Gc in block fermented red meat products（n＝3）

图8 肉糜状发酵肉制品中Neu5G质量分数（n＝3）Fig.8 Content of Neu5Gc in minced fermented red meat products（n＝3）

3 结语

采用酸水解，4，5-亚甲基二氧基-1，2-邻苯二胺盐（DMB）衍生的荧光高效液相色谱（HPLC-FLD）检测发酵红肉制品中Neu5Gc质量分数。该方法分离度良好（R＞1.5），平均回收率在 96.4%～99.07%之间，最低检出限为0.001 μmol/L，Neu5Gc保留时间为14.484 min，且峰形对称无漂移无拖尾。此方法分辨率、灵敏度，精密度和回收率较高，能够满足发酵红肉制品中Neu5Gc的测定，弥补了对发酵红肉制品中Neu5Gc的研究手段的缺失。

采用该方法测得的不同种类的发酵红肉制品Neu5Gc的质量分数在9.59～20.08 μg/g之间，不同的发酵红肉制品Neu5Gc的含量之间均存在显著性差异（p＜0.05），且低于未发酵红肉样 Neu5Gc的含量26.87 μg/g。目前，尚未有微生物发酵对红肉中Neu5Gc影响的研究，进一步研究旨在阐释微生物发酵对Neu5Gc的降解机制。