一株临沧野生黄鸡的鉴定与生长条件研究

周会明，张焱珍，柴红梅，杨荣情，谭 莹，张萍萍，白玉英，赵一莲，金玉洁

(1.滇西科技师范学院 生物技术与工程学院，云南 临沧 677000； 2.云南省农业科学院 生物技术与种质资源研究所，云南 昆明 650221)

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、水1 L，pH自然。

碳源基础培养基：蛋白胨3 g、KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、琼脂15 g、水1 L，pH自然。

氮源基础培养基：葡萄糖20 g、KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、琼脂15 g、水1 L，pH自然。

碳氮比(C/N)基础培养基：KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、琼脂15 g、水1 L、pH自然。

1.2 方法

1.2.1 子实体的采集、分离纯化与培养

在云南省临沧市芒角社区绿化带的草坪采集到一株野生幼嫩子实体，依据其宏观与微观形态特征进行初步鉴定；在PDA培养基上，采用菌肉组织分离法，经25 ℃下遮光培养获得纯培养物，编号为LCT10。

1.2.2 ITS序列分析

菌株在PDA培养基上25 ℃培养10 d，采用CTAB法[11]提取野生菌株LCT10菌丝体DNA，用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)扩增ITS片段[12]。PCR产物在昆明硕擎生物科技有限公司进行序列测定。将测得的ITS序列通过NCBI在线BLASTN检索，与GenBank中的ITS基因序列进行同源性比较，然后利用ClustalX软件对所得序列进行多序列联配分析，并使用MEGA4.0软件构建系统进化树，计算遗传距离[13]。

1.2.3 菌丝体的活化

1.2.4 温度试验

在PDA培养基平板中央接入直径为5 mm的菌块，在温度梯度5、10、15、20、25、30 ℃分别连续恒温黑暗培养22 d，每温度处理3次重复。采用多次十字交叉法测定菌落直径，依据生长时间(d)计算菌丝生长速度(mm·d-1)，根据菌丝浓密程度记录生长势[15]。

1.2.5 pH试验

用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH调节PDA培养基pH至4、5、6、7、8、9、10、11、12。在不同pH的平板中央接入直径5 mm的菌块饼各1块，3个重复，在(25±3)℃黑暗培养20 d。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.2.6 光照试验

1.2.7 通气性试验

接种后于25 ℃恒温黑暗连续培养20 d，培养期间共分成处理1(不处理)、处理2(每隔10 d在酒精灯火焰下通风5 s)、处理3(每隔5 d在酒精灯火焰下通风5 s)及处理4(每隔1 d在酒精灯火焰下通风5 s)4组处理，每处理3个重复。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.2.8 碳氮源试验

在碳源基础培养基上，分别用2%的蜂蜜、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖代替葡萄糖做碳源试验；同样的方法，分别用0.3%的尿素、甘氨酸、硝酸铵代替蛋白胨做氮源试验。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.2.9 C/N试验

在C/N基础培养基上，以葡萄糖为碳源，甘氨酸为氮源，配制C/N分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1的6种培养基。菌落直径、菌丝生长速度、生长势测定方法同1.2.4节。

1.3 统计方法

试验数据均用SPSS 19.0软件进行统计分析[16]。

2 结果与分析

2.1 野生菌株LCT10子实体形态特征

2.2 基于ITS序列系统发育分析

2.3 温度对黄鸡菌丝生长的影响

2.4 pH对黄鸡菌丝生长的影响

2.5 光照对黄鸡菌丝生长的影响

图1 野生黄鸡子实体

图2 基于ITS序列的黄鸡与其他鸡菌属种的邻接法系统发育分析(1 000次重复)

数据为菌丝生长速度的3次重复的平均值和标准差。柱上无相同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。菌丝生长势：+++表示浓密，++表示较浓密，+表示稀疏；-表示不生长。下同。Values represent of 3 replicates of mycelial growth rate. Data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. “+++”indicated that mycelia grew vigorously， “++”indicated that mycelia grew ordinarily， “+” indicated that mycelia grew weakly， “-”indicated that mycelia didn’t grow. The same as below.

2.6 通气性对黄鸡菌丝生长的影响

2.7 碳源对黄鸡菌丝生长的影响

2.8 氮源对黄鸡菌丝生长的影响

2.9 碳氮比(C/N)对黄鸡菌丝生长的影响

图4 pH对黄鸡菌丝生长的影响

图5 光照强度对黄鸡菌丝生长影响的比较

3 结论与讨论

图6 通气性对黄鸡菌丝生长的影响

图7 碳源对黄鸡菌丝生长影响的比较

图8 氮源对黄鸡菌丝生长影响的比较

图9 碳氮比对黄鸡菌丝生长影响的比较