鹌鹑ESR1基因的多态性与蛋品质的关联分析

白俊艳，樊红灯，曹 恒，庞有志，宋晓杰，蒋梦娟，付学言，卢小宁，杨 帅，李新月，郝伟光，李子衡，郑飞扬

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471023)

雌激素受体(estrogen receptor，ESR)是核受体超家族的一员，拥有ESRα和ESRβ两种亚型，作为媒介来转导雌激素的多向性效应。ESRα对生殖系统(子宫、乳腺)的影响是关键性的，而ESRβ主要影响中枢神经系统、免疫系统、心血管系统、泌尿系统，以及肾脏、肺部、骨骼的相关机制[1]。Green等[2]首先克隆获得人的ESRαcDNA序列，长2 092 bp，可编码595个氨基酸。Krust等[3]克隆了鸡的ESRα cDNA序列，大小为2 085 bp，能够对589个氨基酸进行编码。Kuiper等[4]和Mosselman等[5]分别进行了鼠和人的ESRβ cDNA序列的克隆。Ichikawa等[6]克隆出ESR1基因的cDNA，从此其他一些物种的ESRα和ESRβ的cDNA都渐渐被克隆出来。Rothschild等[7]研究发现，ESR基因是影响母猪产仔性状中起关键作用的一个基因。猪的ESR1基因与母猪产仔数存在相关性[8]。由此可见，ESR基因对畜禽繁殖性状具有重要的影响。

鹌鹑因体型小、产蛋大而多、饲料消耗少、生长速度快、培育时间短、生产成本低、经济效益高等优点，具有较强的竞争力和发展前途。鹌鹑蛋中还含有较高的卵磷脂、脑磷脂、维生素和铁等[9]，鹌鹑肉和蛋对于哮喘、结核、代谢障碍以及神经衰弱等疾病还具有一定的治疗作用，具有比较高的药用价值[10]。以上研究表明，ESR基因对畜禽繁殖性状有一定的影响，考虑到基因一般具有一因多效的作用。为此，本实验以北京白羽鹌鹑、中国黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑这3个鹌鹑品种为研究对象，采用PCR-RFLP方法分析鹌鹑ESR1基因的遗传多态性，并对鹌鹑蛋品质进行关联分析，以探讨ESR1基因对鹌鹑蛋品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所取用的实验动物是北京白羽鹌鹑50羽、中国黄羽鹌鹑50羽、朝鲜鹌鹑50羽，采用心脏采血法进行采血，取血后将血液储存在含有EDTA抗凝剂的真空采血管中，放至-20 ℃的冰箱进行冷冻保存以备使用。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA及引物合成

采集鹌鹑心脏血样，采血后做好标记放入-20 ℃冰箱保存。对血液采用酚/氯仿法提取了基因组DNA，该试验中所使用的引物序列参考蒲跃进[11]的方法，ESR1基因外显子4引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成，ESR1基因引物信息见表1。

1.2.2 目的片段的PCR扩增

扩增反应体系为：去离子水5.3 μL，2×TaqPCR Green Mix为7.5 μL，上游引物0.6 μL，下游引物0.6 μL，DNA模板1.0 μL。扩增反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列信息

Table1The information of primer sequence

名称Name引物序列Primersequence(5′-3′)大小Size/bp退火温度Annealingtemperature/℃ESR1-E1F:CAAAGCCCTTGGAGTTAC;R:AGCAGTTCTCCCTACTCC37055.4ESR1-E4F:CGGGCGAATGATGAAACA;R:CCCAGTTGATCATGTGCA30158.0ESR1-E8F:CAACAAAGGAATGGAGCA;R:CCCTTCTTTTGCTGTTAA21253.6

1.2.3 PCR-RFLP分析

限制性内切酶PvuⅡ为ESR1-E1引物扩增的PCR产物进行酶切，酶切反应体系为15 μL：ddH2O 5 μL，PCR产物8 μL，限制性内切酶PvuⅡ(10 U·μL-1)0.5 μL，10×buffer 1.5 μL。混合均匀后置于37 ℃水浴消化4 h。限制性内切酶AccⅠ为ESR1-E8引物扩增的PCR产物进行酶切，酶切反应体系为10 μL：ddH2O 0.5 μL，PCR产物8 μL，限制性内切酶PvuⅡ(10 U·μL-1)0.5 μL，10×buffer 1.0 μL。混合均匀后置于37 ℃水浴消化4 h。酶切产物使用2.0%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，跑胶结束后使用凝胶成像系统进行拍照记录。

1.2.4 扩增产物的测序及序列的比对分析

序列比对主要采用NCBI网站上的BLAST系统对所测基因序列进行对比，通过对比的结果来确认该序列是否为目的序列。测序图谱用Chromas程序进行观察分析以查找潜在的突变位点，并做记录统计。

1.2.5 数据统计分析

多态信息含量(PIC)、杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)用Dispan软件计算。ESR1基因与鹌鹑蛋品质的关联分析统计模型为

yijk=μ+Pi+Mj+eijk。

(1)

式(1)中：yijk为性状表型值；μ为总体均值；Pi为品种效应(i=1，2，3)；Mj为第j种基因型效应；eijk为残差效应；结果用平均值±标准差来表示。

2 结果与分析

2.1 鹌鹑ESR1基因的PCR产物检测

鹌鹑ESR1基因的外显子1、外显子4、外显子8的PCR产物检测结果如图1所示，可以看出检测结果均为单一条带，ESR1基因的外显子1、外显子4、外显子8与目的片段大小一致，表明PCR扩增产物质量达标效果较好。

2.2 鹌鹑ESR1基因的多态性检测

鹌鹑ESR1基因外显子1和外显子8的多态性检测结果如图2所示，可以看出外显子1和外显子8中均检测到3种基因型，ESR1基因外显子1检测到3种基因型分别为TT基因型(370 bp)、CC基因型(330 bp/40 bp)和CT基因型(434 bp/330 bp/40 bp)。ESR1基因外显子8检测到的3种基因型为TT基因型(212 bp)、CC基因型(121 bp)和CT基因型(212 bp/121 bp)。

鹌鹑ESR1基因外显子4的SNP位点测序峰图见图3，可以看出在3个鹌鹑群体中检测到ESR1基因外显子4有1个SNP位点为C50T，检测到3种基因型即CC、CT和TT基因型。

2.3 鹌鹑群体遗传多态性分析

由表2可以看出，ESR1基因外显子1在3个鹌鹑群体中均表现为CC基因型频率最高；ESR1基因外显子8在3个鹌鹑群体中均表现为TT基因型频率最高；ESR1基因外显子4在中国黄羽鹌鹑和朝鲜鹌鹑中均表现为TT基因型频率最高，而在北京白羽鹌鹑中则以CC基因型频率最高。ESR1基因外显子1、外显子4、外显子8在中国黄羽鹌鹑中的杂合度(0.409、0.491、0.464)、有效等位基因数(1.690、1.964、1.860)、多态信息含量(0.326、0.370、0.356)为最高，可见中国黄羽鹌鹑的遗传多态性丰富。

1，中国黄羽鹌鹑；2，北京白羽鹌鹑；3，朝鲜鹌鹑；M，Marker DL2000。1， Chinese yellow quail; 2， Beijing white quail; 3， Korean quail; M， Marker DL2000.

图2 鹌鹑ESR1基因的外显子1(A)和外显子8(B)的多态性检测

图3 ESR1基因外显子4的不同基因型测序峰图

表2ESR1基因的基因型频率和等位基因频率

Table2Gene genotype frequency and allele frequency ofESR1 gene

ESR基因ESRgene群体Group基因型频率GenotypefrequencyCCCTTT等位基因频率AllelefrequencyCT杂合度Hybridization(He)有效等位基因数Numberofeffectivealleles(Na)多态信息含量Polymorphicinformationcontent(PIC)外显子1中国黄羽鹌鹑0.5150.3970.0880.7130.2870.4091.6900.326Exon1Chineseyellowquail北京白羽鹌鹑0.6000.3860.0140.7930.2070.3281.4800.274Beijingwhitequail朝鲜鹌鹑Koreanquail0.7230.2620.0150.8540.1460.2491.3300.218外显子4中国黄羽鹌鹑0.2730.3180.4090.4320.5680.4911.9640.370 Exon4Chineseyellowquail北京白羽鹌鹑0.6670.2350.0980.7840.2160.3391.5120.281Beijingwhitequail朝鲜鹌鹑Koreanquail0.1060.2770.6170.2450.7550.3701.5870.302外显子8中国黄羽鹌鹑0.1270.4760.3970.3650.6350.4641.8600.356 Exon8Chineseyellowquail北京白羽鹌鹑0.0440.3380.6180.2130.7870.3351.5000.279Beijingwhitequail朝鲜鹌鹑Koreanquail0.0340.4410.5250.2540.7460.3791.6100.307

2.4 ESR1基因与鹌鹑的蛋品质关联分析

由表3可以看出，ESR1基因外显子4的CC基因型和CT基因型的蛋黄高度和蛋黄指数要显著高于TT基因型(P<0.05)。TT基因型的蛋黄宽度要显著高于CC基因型和CT基因型(P<0.05)。CT基因型和TT基因型的蛋壳厚度要显著高于CC基因型(P<0.05)。除此之外，ESR1基因外显子4对其他蛋品质无显著影响(P>0.05)。ESR1基因外显子8在蛋黄指数上，CC基因型显著高于CT基因型和TT基因型(P<0.05)，CT基因型和TT基因型之间不存在显著性差异(P>0.05)。CT基因型和TT基因型的蛋黄宽度显著高于CC基因型(P<0.05)。除此之外，ESR1基因外显子8对其他蛋品质无显著影响(P>0.05)。ESR1基因外显子1对所有蛋品质均无显著影响(P>0.05)。

表3ESR1基因与鹌鹑蛋品质的关联结果

Table3Association results ofESR1 gene and quail egg quality

性状TraitsESR1基因外显子1Exon1ofESR1geneCCCTTTESR4基因外显子4Exon4ofESR4geneCCCTTTESR8基因外显子8Exon8ofESR8geneCCCTTT蛋质量Eggweight10.520±0.099a10.544±0.133a10.625±0.364a10.511±0.118a10.380±0.129a10.648±0.142a10.257±0.260a10.591±0.124a10.512±0.105a蛋长端Egglongend31.815±0.153a31.994±0.182a32.255±0.781a31.898±0.207a31.562±0.212a32.085±0.192a31.166±0.42a32.006±0.156a31.873±0.180a蛋短端Eggshortend24.926±0.078a24.856±0.123a24.908±0.235a24.876±0.103a24.809±0.112a24.980±0.110a24.799±0.168a24.925±0.103a24.892±0.083a蛋形指数Eggshapeindex1.277±0.006a1.288±0.006a1.295±0.028a1.283±0.008a1.273±0.008a1.285±0.006a1.256±0.014a1.285±0.006a1.281±0.007a蛋黄高度Eggyolkheight7.478±0.108a7.453±0.153a7.675±0.320a7.749±0.119a7.514±0.175a7.162±0.141b7.786±0.142a7.402±0.133a7.503±0.125a蛋黄宽度Eggyolkwidth25.367±0.201a25.527±0.257a25.105±0.342a25.027±0.247b25.067±0.299b26.018±0.258a24.267±0.701b25.557±0.253a25.417±0.210a蛋黄指数Eggyolkindex0.298±0.006a0.295±0.008a0.309±0.025a0.305±0.009a0.303±0.009a0.278±0.007b0.323±0.015a0.293±0.007b0.298±0.006b蛋黄质量Eggyolkweight3.459±0.041a3.456±0.053a3.525±0.250a3.417±0.058a3.400±0.055a3.546±0.048a3.357±0.139a3.460±0.050a3.470±0.043a蛋壳厚度Eggshellthickness0.170±0.002a0.172±0.003a0.172±0.003a0.165±0.002b0.173±0.003a0.176±0.003a0.170±0.007a0.169±0.002a0.172±0.002a蛋白高度Proteinheight1.709±0.054a1.537±0.074a1.785±0.359a1.725±0.070a1.671±0.085a1.585±0.072a1.739±0.199a1.711±0.078a1.593±0.054a

同行数据后没有相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

The values in the same row with different lower-case letters showed significant differences (P<0.05).

3 讨论

3.1 ESR1基因在鹌鹑群体中的多态性

季华员等[12]研究发现，ESR1基因在东乡绿壳蛋鸡群体中的外显子1有5个突变位点，外显子4和8各有1个突变位点。王洪才等[13]研究庄河大骨鸡ESR基因发现了CC、CD和DD这3种基因型。张舒等[14]研究发现，在肉鸽中存在两种ESR基因型AA和AB。本研究中，使用ESR1基因的外显子1、外显子4、外显子8在3个品种的鹌鹑群体中进行多态性检测，均检测到3种基因型，ESR1基因外显子4上均有1处SNP突变位点(C50T)，且外显子4在中国黄羽鹌鹑、朝鲜鹌鹑两个群体的T等位基因频率均高于C等位基因频率，等位基因T为该两个群体的优势等位基因。这与蒲跃进[11]对我国神丹Ⅰ号鹌鹑的H系、L系及野生鹌鹑3个群体的ESR1基因C50T位点的研究结果相似。

3.2 ESR1基因与鹌鹑蛋品质的关联分析

ESR基因与繁殖性能的关联分析在其他畜禽的研究中报道较多，如徐小波等[15]研究表明，二花脸猪的ESR基因BB型初产及经产总产仔数(TNB)和产活仔数(NBA)均高于AB型(P<0.05)和AA型(P<0.01)。唐现文等[16]研究表明，ESR基因在苏姜猪的3个世代中BB型基因的第2～4胎总产仔数显著高于AA和AB的第2～4胎总产仔数。于吉英等[17]研究发现，ESR基因与文昌鸡的300日龄的产蛋数之间存在显著相关(P<0.05)，而与文昌鸡个体的连产天数存在极显著相关(P<0.01)。季华员等[12]对东乡绿壳蛋鸡的ESR1基因的多态性研究发现，ESR1基因外显子4的突变位点(C267T)产生的3种基因型与东乡绿壳蛋鸡300日龄的平均产蛋量存在明显相关(P<0.05)。王洪才等[13]对庄河大骨鸡的ESR基因的CC基因型的产蛋数和料蛋比等性状指标显著高于该位点其他基因型(P<0.05)。陈燕等[18]在对文昌鸡和巴布考克蛋鸡研究时，在2个群体鸡ESRα基因的5′端检测到了4个突变位点(A34G、T76C、T79C、C102T)，但这4个突变位点对鸡的产蛋性状并没有显著影响。涂小璐[19]对皖西白鹅研究发现，ESR1基因内含子上的A105G突变位点所含有的几个基因型与鹅的产蛋量、开产蛋重和开产体重等产蛋性状不存在相关性。谢三磊等[20]研究发现，ESRβ基因与黑羽鹌鹑的产蛋性能存在一定相关性。

而ESR基因与家禽蛋品质关联分析报道较少，仅见韦雄等[21]研究发现，在长顺绿壳蛋鸡群体中ESR1基因外显子5前有一个SNP位点-999 bp(上有A、C两个等位基因)，该突变位点上的3种基因型(AA、AC、CC)与长顺绿壳蛋鸡产蛋的蛋壳厚度存在相关；蒲跃进[11]研究发现，ESR基因外显子8与鹌鹑的20周蛋质量之间存在相关(P<0.05)。本研究表明，ESR1基因外显子4和外显子8主要对蛋黄高度、蛋黄宽度、蛋黄指数、蛋壳厚度有显著影响(P<0.05)，这一结果与蒲跃进[11]、韦雄等[21]的研究结果相似。因此，推测ESR1基因可能为蛋用鹌鹑的蛋品质相关的候选基因，可以作为有价值的候选基因应用于蛋用鹌鹑的分子标记辅助选择。