盐酸小檗碱联合甘草酸二铵对非酒精性脂肪性肝病患者Th17/Treg细胞失衡及肠道菌群的影响

黄佩佩 胡云明 吴建胜

非酒精性脂肪性肝病以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要病理特征，包括从单纯肝脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎，一些患者最终可演变为肝硬化甚至肝细胞癌[1]。据报道一般人群的非酒精性脂肪性肝病发生率为10%～16%，而在肥胖患者中发生率高达38%，近年来随着人们工作压力的增加，饮食、生活习惯不规律，非酒精性脂肪性肝病的发生率呈逐年上升趋势[2]。目前临床对非酒精性脂肪性肝病尚缺乏特效治疗药物，治疗方法主要是改变患者的生活方式、减轻体质量等[3]。盐酸小檗碱片是从中药黄连根茎中提取的主要生物碱，对糖尿病、高脂血症、肥胖症等代谢综合征起到了防治疗效，也是一种治疗非酒精性脂肪性肝病的药物。甘草酸二铵肠溶胶囊能够促进非酒精性脂肪性肝病患者的糖脂代谢好转，有抗炎、改善胰岛素抵抗以及保护肝细胞等作用[5]。然而目前采取水飞蓟宾胶囊联合盐酸小檗碱片治疗非酒精性脂肪性肝病的研究鲜见报道。非酒精性脂肪性肝病是一种多因素作用所导致的临床病理综合征，免疫功能失衡和肠道菌群紊乱在该病的发生、发展过程中发挥了重要作用[6,7]。基于此，本研究选取温州医科大学附属乐清医院2017年2月～2018年8月收治的104例病例作为研究对象，观察盐酸小檗碱片联合甘草酸二铵肠溶胶囊治疗非酒精性脂肪性肝病的治疗效果，并探讨其对调节性T 细胞(Treg)/辅助性T细胞17(Th17)平衡以及肠道菌群的影响。

对象与方法

1.研究对象: 104例非酒精性脂肪性肝病患者来源于温州医科大学附属乐清医院2017年2月～2018年8月收治病例，非酒精性脂肪性肝病诊断参照《中国非酒精性脂肪性肝病诊疗指南(2010 年修订版)》拟定[8]。纳入标准：①符合非酒精性脂肪性肝病诊断标准者；②患者年龄20～65岁；③丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常升高≥4周；④近1个月内未给予相关药物治疗；⑤患者自愿参加，且签署知情协议。排除标准：①饮酒史或乙醇量女性每周>70克/周，男性>140克/周；②伴病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝病、肝豆状核变性病等其他肝病;③对本研究药物过敏者；④合并心脑血管、肾脏、造血系统等严重疾病；⑤患精神疾病者。两组治疗过程中均未出现脱落病例，将104例患者按数字表法随机分为对照组和观察组，每组各52例。对照组男性31例，女性21例，年龄44～62岁，平均年龄55.17±7.12岁，病程3～7年，平均病程5.11±0.71年，体重指数25.15±3.04kg/m2；并发症：2型糖尿病8例，高血压15例，高脂血症19例。观察组男性33例，女性19例，患者年龄46～61岁，平均年龄55.39±7.04岁，病程2.5～7.0年，平均病程5.01±0.67年，体重指数25.09±3.04kg/m2；并发症：2型糖尿病7例，高血压13例，高脂血症18例。上述基本临床资料两组患者比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.方法：(1)基础治疗：依据指南[8]给予非药物干预措施。包括对患者进行健康教育；平衡膳食，控制体重；注意休息，适当有氧运动(每周>4次，每次>30min)。对照组：采取甘草酸二铵肠溶胶囊(正大天晴药业集团股份有限公司，批准文号H20040628)，口服，3粒/次，3次/天。观察组：在对照组治疗基础上给予盐酸小檗碱片(南京白敬宇制药有限责任公司，批准文号H32023081)，口服1～3片/次，3次/天。两组疗程均为12周。

3.观察指标：(1)肝功能：采取全自动生化分析仪(AU5800，美国Beckman Coulter公司)测定患者的谷草转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)以及谷氨酰转肽酶(GGT)，在治疗前及治疗12周后各测1次。(2)血脂:采取全自动生化分析仪(AU5800，美国Beckman Coulter公司)检测患者的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，在治疗前及治疗12周后各测1次。(3)两组外周血辅助性T细胞17(Th17)和调节性T细胞(Treg)水平:清晨空腹下抽取患者的外周血3ml左右，常规离心后将其加入磷酸盐缓冲液洗涤，制备细胞悬液；采取流式细胞仪(FC-500型，美国Beckman Coulter公司)在治疗前及治疗12周后测定，其中Th17细胞为CD4+白细胞介素(IL)-17+，Treg细胞为CD 4+CD25+CD127lowTreg。(4)两组肠道菌群测定:标本取样：在治疗前及治疗结束后留取患者的自然排便新鲜粪便中段0.5g，置于样本袋存于-4℃冰箱。标准菌株DNA提取：取双歧杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、肠球菌冻干粉各0.2g，溶解于磷酸缓冲液溶液中，采用细菌DNA提取试剂盒提取标准菌株DNA，采用紫外分光光度计定量，进行10倍稀释，采用系统软件分析循环阈值(Ct)，生成标准曲线，计算标准品PCR片段拷贝数。样本细菌DNA提取、16SrDNA定量PCR：粪便样本融冻，取0.2g以磷酸盐缓冲液处理，1000r/min离心10min，取上清200μl，同标准菌株DNA提取法提取样本细菌DNA，以标准菌株16SrDNA V3区为PCR靶基因，采用Primer Premier 6.0引物设计软件设计PCR引物，对样本细菌DNA提取液施行PCR反应，生成样本细菌Ct值，计算样本拷贝数。(5)疗效评定标准[9]:根据患者的肝脏酶学改变制定。临床控制：肝脏酶学恢复正常；显效：肝脏酶学指标降低≥50%；有效：肝脏酶学指标降低<50%但≥30%；无效：肝脏酶学指标降低<30%。总有效率(%)=(临床控制+显效+有效)人数/各组人数。

结 果

1.两组肝功能比较：治疗12周后，两组患者肝功能AST、ALT、GGT水平明显降低(P<0.01)；且观察组治疗后AST、ALT、GGT水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表1。

表1 两组肝功能比较

2.两组LDL-C、TC、TG、HDL-C比较：治疗12周后，两组HDL-C明显升高，LDL-C、TC和TG明显降低(P<0.01)；且观察组患者治疗12周后 LDL-C、TC和TG少于对照组，HDL-C高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表2。

表2 两组LDL-C、TC、TG、 HDL-C比较

3.两组肝脏酶学疗效比较：治疗12周后，观察组总有效率为94.23%，显著多于对照组(76.92%,χ2=4.986，P<0.05)，详见表3。

表3 两组肝脏酶学疗效比较[n(%)]

4.两组外周血Th17和Treg细胞水平比较：治疗12周后，两组患者外周血Th17细胞、Treg细胞以及Treg/Th17比值显著减少(P<0.01)；且观察组治疗12周后外周血Th17细胞、Treg细胞以及Treg/Th17比值少于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，详见表4。

表4 两组外周血Th17和Treg细胞水平比较

5.两组肠道菌群比较：治疗12周后，两组患者的双歧杆菌、乳酸杆菌水平显著升高，大肠杆菌明显减少(P<0.01)，且观察组患者的双歧杆菌、乳酸杆菌显著高于对照组，大肠杆菌明显低于对照组(P<0.01)；两组治疗前肠球菌水平变化比较，差异无统计学意义(P>0.05)，详见表5。

表5 两组肠道菌群比较拷贝数/克)

讨 论

非酒精性脂肪性肝病是临床常见慢性肝病之一，患者常合并代谢综合征，与胰岛素抵抗、肥胖、遗传易感等密切相关，但其发病机制尚待阐明。目前现代医学普遍认为“二次打击”学说是非酒精性脂肪性肝病发生、发展的主要机制之一，初次打击为脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗导致体内的肝细胞脂质沉积形成单纯性脂肪肝；第2次打击为多种因素诱发氧化应激、脂质过氧化损害，从而损伤肝脏以及导致肝细胞变性、坏死，形成脂肪性肝炎[10,11]。

盐酸小檗碱通过兴奋胰岛素受体mRNA转录以及蛋白激酶C依赖激活启动子增加胰岛素受体基因表达，促进胰岛素受体的生成，进而增加胰岛素的敏感度；同时也通过抑制线粒体和激活腺苷酸活化蛋白激酶，下调肝糖异生基因以及脂肪合成基因，调节异常脂质代谢，达到降血脂、血糖的作用[12,13]。甘草酸二铵肠溶胶囊为甘草酸二胺和磷脂酰胆碱的新型复合物，甘草酸二胺有较强的抗炎、保护肝细胞及改善肝功能的作用；磷脂与肝细胞膜有较高的亲和性，可维持细胞膜的流动性、保护肝细胞膜，磷脂中的胆碱对脂肪有一定的亲和力，可有效降低血清甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇[14]。甘草酸二铵与磷脂结合以后，脂溶性明显增高，生物利用度也明显增加，产生协同效应，临床可用于治疗急、慢性病毒性肝炎等所引起的肝功能异常，亦能降低非酒精性脂肪性肝病患者的转氨酶及血脂升高[15]。

本研究结果显示，治疗12周后，观察组治疗后AST、ALT、GGT水平以及LDL、TC和TG低于对照组，HDL-C高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，提示盐酸小檗碱片联合甘草酸二铵肠溶胶囊治疗非酒精性脂肪性肝病可促进患者肝功能和血脂水平好转。治疗12周后疗效统计发现，观察组总有效率为94.23%，显著多于对照组(76.92%)，说明盐酸小檗碱片联合甘草酸二铵肠溶胶囊治疗非酒精性脂肪性肝病的疗效更佳，值得临床借鉴。

非酒精性脂肪性肝病的“二次打击”学说认为免疫系统激活是第2次打击的主要参与因素之一，其中免疫微环境的改变是其重要病理特征，与免疫炎性细胞因子失衡有关[16]。Th17细胞均为CD4+淋巴细胞亚群，其主要分泌或诱导白细胞介素、肿瘤坏死因子-α 等促炎性细胞因子，介导炎性反应，造成肝组织损害[8]。Treg细胞也是CD4+淋巴细胞亚群之一，可通过分泌转化生长因子-β以及细胞直接接触，并作为抗原呈递细胞的各种免疫细胞发挥直接作用，促进肝脏发生纤维化[17]。Th17细胞、Treg细胞相互作用，在生理状态下保持平衡以维持机体免疫内环境的稳定。唐涛等[18]研究发现，非酒精性脂肪性肝病患者外周血中Th17和Treg细胞在T 淋巴细胞中的比例均显著升高并且Th17/Treg的比例也明显增加，与胰岛素抵抗存在一定的相互作用，参与了非酒精性脂肪性肝病的发生、发展过程。本研究观察组外周血Th17细胞、Treg细胞以及Treg/Th17比值明显少于对照组，提示盐酸小檗碱片联合甘草酸二铵肠溶胶囊可能通过调节Th17/Treg细胞对非酒精性脂肪性肝病起到一定治疗作用。

肠道与肝脏在结构与功能上存在解剖学、病理生理联系，肠道菌群的紊乱是非酒精性脂肪性肝病的病理机制之一。肠道有害细菌过多及益生菌减少，引起有害代谢物质产生过多，并进入肝脏导致肝脏炎性反应、氧化应激等，形成肝脂肪变性和纤维化；肝脏疾病患者的肠道菌群营养底物、胆汁分泌以及肠道内胆盐不足，门静脉回流受阻，导致胃肠道淤血内积，肝脏分泌大量炎性因子，加重肠道菌群失衡[19]。易艳容等[20]研究显示，非酒精性脂肪性肝病患者的肠道有益菌双歧杆菌及乳杆菌数量显减少，有害菌肠杆菌和肠葡萄球菌数量明显增加，使肠源性内毒素增多，引起炎性介质的大量释放，进一步损害肝细胞。本研究结果显示，观察组的双歧杆菌、乳酸杆菌显著高于对照组，大肠杆菌明显低于对照组。朱超霞等[21]研究发现，小檗碱可能通过改善肠道菌群的结构和减轻高脂饮食所致肠道黏膜损伤，对高脂饮食所诱导的非酒精性脂肪性肝病发挥治疗作用。提示盐酸小檗碱片联合甘草酸二铵肠溶胶囊通过调节肠道菌群紊乱可能是其治疗非酒精性脂肪性肝病的有效途径之一。

综上所述，盐酸小檗碱片联合甘草酸二铵肠溶胶囊治疗非酒精性脂肪性肝病可促进患者肝功能和血脂水平的改善，提高疗效，调节Th17Treg细胞失衡和改善肠道菌群紊乱可能与上述治疗效果有关。