不同厂家猪血清配制的培养基培养猪肺炎支原体的比较研究

李天增，候 凤，李新苹，王 钢，贺 笋

（天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011）

猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）可引起猪支原体肺炎，又称地方流行性肺炎，是猪的一种慢性消耗性呼吸道病，临床感染率极高。其主要症状为咳嗽和气喘，以高发病率和低死亡率为特点。猪群一旦感染Mhp，便难以清除，不仅严重影响猪群的生长发育，用药量增加，而且容易继发感染PRRSV、PCV等，从而导致多种疫苗接种失败[1-2]。本病的预防应采用综合的措施，给猪提供一个理想的环境是基础，包括通风、温度及合理的饲养密度和饲养方式，药物治疗虽有效，但由于长期治疗耗费大量药物，并带来肉质药物残留的突出问题，因此，疫苗免疫是预防本病的最主要手段[3-4]。

目前，我国在动物疫苗技术研发与世界先进水平相比还存在较大差距，猪肺炎支原体的培养难度很大，传统的培养方式耗时长，并且滴度不高，是目前支原体疫苗规模化生产的技术瓶颈。针对猪肺炎支原体的培养现状，改进了培养基的配方，选择猪血清作为培养基的添加血清，并且比较了不同厂家的猪血清，最后选择厂家1的猪血清作为配制改良Friis培养基用猪血清。

1 材料

1.1 菌种

猪肺炎支原体CJ株，由天康生物股份有限公司分离、鉴定、保管和供应。

1.2 试剂

健康猪血清分别购自国外和国内的6个厂家；PPLO肉汤粉、BHI均购自美国BD公司；配制培养基用水由Millpore纯水仪制备；氯化钙、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钠、酚红、青霉素均为国产试剂。

2 方法

2.1 液体培养基的配制

该培养基改良于Friis培养基。称取脑心浸液粉末以及PPLO肉汤粉末，加入纯水中。隔水加热，冷却至45℃以下。加入Hank'A及Hank'B溶液，以及青霉素。待其溶解后再加入酵母浸出液以及酚红。最后分别与经灭补体处理过的不同厂家的猪血清混合均匀并调整pH值。配制的改良Friis培养基置于2～8℃下保存备用。随机挑选1～2瓶改良Friis培养基按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

2.2 种子液的培养

从菌种库中取出湿毒，分别用配制的改良Friis培养基溶解，并按1∶10～1∶15分别继代于不同血清配制的改良Friis培养基中，置于36～38℃恒温振荡培养箱中，以50～75 r/min振荡培养，待菌液pH值降低至6.70～6.80时收集菌液，进行含菌量测定。

2.3 含菌量的测定

取菌种依次10倍系列稀释，稀释度达到10-1、10-2、10-3……10-12。再设改良 Friis培养基作对照，置36～38℃恒温振荡培养箱内培养14日。每日观察记录培养基颜色变化和混浊度的变化。直至培养物pH值不发生变化，最后发生颜色变化的稀释度即为该培养物的CCU滴度。并依上法测定3次。

3 结果

3.1 猪肺炎支原体CJ株接种6种培养基的生长时间及含菌量测定结果

将猪肺炎支原体CJ株接种不同培养基后在相同的条件下培养，其生长时间及含菌量的测定结果见表1。

表1 猪肺炎支原体CJ株接种6种培养基的生长时间及含菌量的测定结果

由表1中6种不同厂家猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间可知，猪肺炎支原体CJ株在厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基中生长时间为2～3日；猪肺炎支原体CJ株在厂家2、3、4、5、6的猪血清配制的改良Friis培养基中生长时间为3～4日。以上结果表明，由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基更适宜猪肺炎支原体CJ株的生长。

由表1中6种不同厂家猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株测定的含菌量测定结果可知，猪肺炎支原体CJ株在厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基中的含菌量（以及达到最终含菌量所用时间）为 1.0×109-10CCU/ml（10日 ）， 在 2、3、4、5、6的猪血清配制的改良Friis培养基中的含菌量（以及达到最终含菌量所用时间）分别 为 1.0×108～ 109CCU/ml（11～ 12日 ），1.0×108CCU/ml（13日），1.0×108CCU/ml（11 ～ 12日），1.0×109CCU/ml（10～11日），1.0×108CCU/ml（13日）。以上结果表明，由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株的含菌量较高。

3.2 数据分析

将6种不同厂家猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株含菌量的结果进行对数化处理，并运用Prism 5.0统计分析软件进行数据分析。表2结果显示，由厂家1的猪血清配制的培养基培养猪肺炎支原体CJ株的含菌量较高，与厂家5的猪血清配制的培养基差异不显著，与另4种厂家猪血清配制的培养基均有显著差异，而另4种厂家猪血清配制的培养基之间无显著差异。

4 结论

由于支原体很小而产量又少，所以常用的定量估计菌体的方法（如浊度、细胞容积和干重）不适用于猪肺炎支原体的定量检测。适合一般应用的定量测定支原体的主要方法有：浓缩培养物的浊度测定、用菌落计数测量活菌数和用测定变色单位测量活菌数[3、5]。CCU计数法比较直观，其测定的是培养物中的活菌数，结果更具有代表性，仍是测定支原体含量的经典方法，也是兽用生物制品目前仍采用的方法，广泛运用于支原体的培养检验、活疫苗的保存条件检测等，在检测疫苗活菌数的应用中具有不可替代的作用[6-7]。

将猪肺炎支原体CJ株接种由不同厂家猪血清配制的改良Friis培养基，从生长时间和含菌量测定结果可以看出，由厂家1的猪血清配制的改良Friis培养基培养猪肺炎支原体CJ株的生长时间短且含菌量高，最终选择厂家1的猪血清作为猪肺炎支原体CJ株培养用血清。

表2 猪肺炎支原体CJ株接种6种培养基的含菌量测定结果比较