辣木抗氧化成分提取方法和抗氧化能力研究进展

普天磊,韩学琴,邓红山,廖承飞,罗会英,范建成,金 杰

(云南省农业科学院热区生态农业研究所,元谋干热河谷植物园,云南元谋 651300)

辣木(MoringaoleiferaLam)别名洋椿树、鼓槌树、不死树等,为辣木科辣木属植物,其下属有13个种,在亚洲南部、非洲西南部及东北部、马达加斯加均有分布,为多年生热带落叶乔木[1-2]。辣木富含抗氧化活性成分,如多糖类、酚酸类、维生素类等,是良好的天然抗氧化剂来源[3],摄入此类抗氧化剂可增强机体对抗自由基的能力,对预防或延缓疾病发生,改善生活质量,节约医疗成本有重要的意义。

自由基是带有一个或多个未配对电子的分子,未配对电子性质不稳定,有很高的反应活性,在药物、炎症、压力和饮酒等诱发条件下,未配对电子释放,体内自由基积累,易造成机体的氧化损伤,破坏细胞膜、蛋白质和核酸,扰乱机体的正常生理功能,导致癌症、动脉粥样硬化、糖尿病等慢性疾病产生[4]。机体的氧化损伤程度可由抗氧化剂来调节,寻求有效的抗氧化剂成为预防、治疗器官、组织自由基损伤的关键问题。本文通过总结近几年来国内外辣木抗氧化研究方面的文献,归纳探讨了辣木所含有抗氧化作用的活性成分提取方法、含量分布、作用机制以及体内外研究方法,较为详实地阐述了辣木抗氧化作用的研究进展,以期为辣木抗氧化活性物质的开发和利用提供研究依据。

1 辣木中的抗氧化成分、提取方法、含量及其抗氧化机制

1.1 多糖类

1.1.1 多糖种类和存在部位 多糖是由多个单糖以糖苷键相连而成,是除蛋白质和核酸之外的一类重要的高分子化合物,辣木中含有丰富的多糖,含量范围在8.61%～33.61%[5]。董竹平等[6]发现辣木叶多糖是β构型的酸性呋喃多糖,且PKM1品种多糖呈链状构象,而PKM2和非洲品种多糖呈类球形构象。汪芳等[7]表明辣木多糖主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖及半乳糖组成,单糖摩尔比为0.49∶3.65∶0.63∶1.27,同时还从辣木叶中分离纯化到2个主要多糖组分即MOs-2-a、MOs-2-b。

多糖在辣木不同部位的含量分布情况有所不同,任飞等[8]表明辣木多糖在不同部位的含量随着采收期的不同而发生变化,多糖含量高低趋势为:茎>叶片>叶柄。孙鸣燕[9]采用回流法对辣木根、种子、叶、叶柄中的多糖进行测定,表明辣木多糖含量分别为:33.61%、19.58%、21.80%、8.16%。任安祥等[10]对辣木茎、叶、种子中的多糖进行测定,发现茎中多糖含量最高,其次为种子,最低为叶片。

1.1.2 多糖提取方法 目前辣木多糖的提取方法主要有热水浸提法、回流提取法、超声提取法、酶提取法及协同提取法等。王振西[11]分别采用热水提取法、超声法和超声协同复合酶法对辣木中的多糖进行提取研究,表明上述三种提取法多糖提取率分别为7.86%、18.12%和33.03%。孙鸣燕[9]分别比较水提法、回流法、酸提法、常规法和超声法对辣木多糖含量的影响,发现上述五种提取方法的多糖得率分别为17.10%、19.61%、18.08%、17.54%、20.17%。赵谋明等[12]比较不同提取方式对辣木中多糖类提取率的影响,发现提取率的高低顺序为:木瓜蛋白酶提取法>超声提取法>高温水提法。上述提取方法中热水浸提法具有操作简单、溶剂安全易得等优点,但提取时间长,水提液杂质较多,后续需采用Sevage法、醇沉法或凝胶柱色谱等方法进行分离纯化,去除水提液中的蛋白和极性较大的非糖杂质,分离纯化步骤较为繁琐复杂。超声法的多糖提取率高,提取时间短,溶剂用量少,提取温度适宜,但其机械剪切效应、热效应和空化效应在破碎样品细胞组织的同时很可能会导致多糖分子结构的改变。酶提取法可迅速破坏植物细胞壁,切断并释放与组织蛋白连接的多糖,反应耗时短,不会对多糖结构和活性造成影响,但酶成本较高,在高温、强酸、强碱等条件下易变性失活,难以实现工业化生产。回流法是目前较常用的多糖提取方法,该法提取率高,对设备要求低,可用于大规模生产。

1.1.3 多糖抗氧化活性作用机理 多糖有显著的抗氧化作用,其抗氧化作用有多途径、多靶点、多效应的特点。核因子相关因子2(Nrf2)是细胞产生氧化应激反应的关键因子,当发生氧化应激时,Nrf2可与抗氧化反应元件(ARE)相互作用,调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶(可将外来致癌物质与内源性小分子,如GSH,通过共价键结合使其失效的酶)的表达[13],从而产生抗氧化效应。多糖可通过Nrf2/ARE内源性抗氧化通路,调节编码下游抗氧化酶基因的表达,进而阻断自由基链式反应,减少自由基的生成[14];其次,多糖可抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达,减少NO活性分子生成,明显增加抗氧化能力,减少氧化应激损伤[15-16]。

1.2 多酚类

1.2.1 多酚种类和存在部位 植物多酚是一类含有多个酚羟基并具有多种生物学活性的次生代谢产物,在植物中普遍存在,具有良好的抗氧化活性。多酚类包括黄酮类、酚酸类、单宁类、花色苷类等,辣木中多酚类成分主要为黄酮和酚酸两类。Singha等[17]从辣木种子中检测出10种酚酸类成分,分别为没食子酸、儿茶素、表儿茶素、香豆酸、阿魏酸、香草醛、咖啡酸、原儿茶酸、肉桂酸、槲皮素。周丹蓉等[18]从辣木叶的石油醚部分分离得到4个黄酮苷类化合物:β-谷甾醇、胡萝卜苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷。高秋玉等[19]采用高效液相色谱法测定辣木叶中的酚酸类成分新绿原酸和黄酮类成分异槲皮苷,并表明此类成分有良好的自由基清除能力。

多酚是辣木抗氧化成分的重要来源,其分离测定部位研究主要集中于叶片中。杨迎等[20]以乙醇为溶剂提取辣木籽中的多酚成分,提取量为4.12 mg/g。刘能等[21]采用乙醇提取辣木叶中多酚和黄酮类成分,含量分别为69.36、53.72 mg/g。辣木叶中的多酚类成分明显高于辣木籽,推荐辣木多酚类成分的最佳研究和开发部位应为叶片。

1.2.2 多酚提取方法 辣木多酚的提取方法有溶剂提取法、超声法、高压热水提取法等。杨迎等[20]以乙醇为溶剂,提取辣木籽中的多酚成分,提取量为4.12 mg/g,并表明该成分有一定的抗氧化活性。该法操作简单,但耗时长,同时该法是根据溶剂与辣木多酚相似相溶的原理进行提取,一般选用溶剂极性较大的有机试剂,易造成有机溶剂残留。Matshediso等[22]采用高压热水提取辣木叶中的黄酮和多酚类化合物,25 ℃时槲皮苷提取量为1429 mg/kg,山奈酚提取量为3030 mg/kg,并表明高温会导致酚类成分的降解,提取温度以100 ℃为宜。该法提取时间短,提取率高,可避免有机溶剂残留,有着可观的应用前景。赵谋明等[12]采用水提法、超声法、胰酶提法对辣木叶中的多酚类物质进行提取,提取率分别为18.54、19.27、28.21 mg/g。林诗洋等[23]采用超声波辅助提取辣木叶中的多酚及类黄酮成分,提取率为64.41和27.43 mg/g,笔者发现两个文献提取方法虽同为超声法,但提取率却有差异,这可能与提取工艺条件、辣木品种、采收时间、产地等因素有关。

1.2.3 多酚抗氧化活性作用机理 多酚类化合物可向自由基提供电子,形成酚类游离基,这种游离基没有适合氧分子进攻的位置,性质比较稳定,不会引发新的链反应而被迅速氧化,从而有很好的抗氧化作用。多酚类物质的抗氧化活性取决于羟基的数量和位置,羟基化作用越强,抗氧化活性越强[24]。辣木中的多酚类物质主要有黄酮类和酚酸类,黄酮类可向自由基提供氢原子,形成共振稳定的半醌基,从而具有清除超氧阴离子自由基等的能力;还可螯合金属离子,阻断产生活性氧的芬顿反应,而具有抗氧化能力。此外,该成分能抑制脂氧合酶和环氧合酶等氧化还原酶的活性,阻止活性氧的生成[24]。酚酸类化合物可提供氢原子或单电子以稳定自由基,中止自由基引发的氧化反应;还能抑制铁离子诱导的脂质氧化,使其具有很好的自由基清除能力。同时,多酚还能调节Nrf2-ARE途径中的抗氧化酶和肽的表达,激活机体的抗氧化反应元件[25]。

1.3 维生素类

1.3.1 维生素种类及存在部位 早在二十世纪60年代,就有相关研究表明维生素有良好的抗氧化作用[26]。辣木中含有丰富的维生素类,包括VE、β-胡萝卜素、维生素B2、VC、叶酸、泛酸等[27]。

相关研究表明,辣木叶中的VC含量远高于芥蓝、菠菜、地瓜等常见植物,是胡萝卜的2倍;辣木中的VE含量也较高,是黄豆粉的5倍[28]。刘昌芬等[28]测定发现每100 g辣木叶干粉中含155.67 mg VE、73.90 mg VC、0.99 mg维生素B2、1.18 mg叶酸和4.32 mg泛酸。高敏霞等[29]测定辣木叶片中的VC含量,发现VC含量随叶片的成熟和衰老而降低,采摘幼嫩叶可获得更高含量的VC。杨东顺等[30]比较了辣木不同部位的VC含量,表明VC含量顺序为叶>籽>茎。郭刚军等[31]对多油辣木不同部位的维生素含量进行分析,发现多油辣木中含有VE、VC、β-胡萝卜素、叶酸、维生素B6等多种维生素,有抗氧化活性的三种维生素含量分别为:VC188.20 mg/100 g、VE4.15 mg/100 g、β-胡萝卜素0.1 g/kg;其中VE集中分布于辣木叶中,VC与β-胡萝卜素的含量分布相似:叶>果>茎>根。

1.3.2 维生素抗氧化活性作用机理 VC是一种水溶性抗氧化剂,在血浆中有较强的抗氧化活性,可提供2个电子供体与羟自由基、氧自由基、氢过氧自由基等多种自由基迅速反应,生成半脱氢抗坏血酸,缓解氧自由基和硝基自由基的负面作用[32]。VE是作用于生物膜的脂溶性抗氧化剂,可提供氢离子与脂氧自由基、脂过氧自由基反应,使脂质过氧化链式反应中断,从而防止细胞膜内及膜上的不饱和脂肪酸被氧化破坏,保护细胞膜的完整性;此外VE还能淬灭单线态氧,提高油的抗氧化能力[33]。β-胡萝卜素属于维生素A原,是一种脂溶性抗氧化剂,保护脂质膜免受过氧化损伤。β-胡萝卜素可与有机过氧化自由基结合,阻断反应链而产生抗氧化作用。

2 辣木抗氧化能力的体内、体外评价方法

2.1 体外抗氧化研究

体外抗氧化研究主要是在体外模拟氧化反应过程,通过化学试剂,测定辣木中相关成分的还原能力、自由基清除能力及抑制脂质过氧化能力等指标,以评价这些成分的抗氧化能力大小[36]。

表1 体外清除自由基评价方法Table 1 The evaluation methods of free radical scavenging in vitro

2.2 体内抗氧化研究

体内抗氧化研究主要通过检测辣木抗氧化物质对动物模型相关抗氧化指标的影响,以反应其抗氧化作用的强弱。机体内有许多酶及非酶保护屏障对抗自由基造成的DNA、蛋白质等大分子物质的损伤,如通过SOD、CAT、GPx、GST、还原型谷胱甘肽(GSH)等酶的作用,可防御自由基造成的氧化损伤,实现内源性自我保护[48]。其中,SOD可催化超氧化物自由基使其转变成O2和H2O2;CAT可将H2O2分解成O2和H2O,进而防止H2O2转化成羟基自由基;GPx可在GSH或其他硫醇的共同作用下,清除ROS、过氧化氢、脂及磷脂自由基,保护膜结构。与此同时,脂质过氧化会破坏细胞膜结构,是造成机体广泛性氧化损伤的另一重要途径。MDA是脂质氧化的最终降解产物,其含量可间接反映体内脂质的氧化反应程度[49]。

辣木抗氧化成分可改变机体内的抗氧化酶活性,防止脂质氧化,从而发挥抗氧化保护作用[57]。此外,Gilani等表明辣木叶中含有SOD和CAT酶,可有效调节肝脂的过氧化作用[58]。Omodanisi等[53]研究辣木叶甲醇提取物对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的抗氧化能力,采用酶标仪测定大鼠肾中的CAT、SOD、GSH活力,高效液相色谱仪测定MDA含量,发现糖尿病大鼠的CAT、SOD、GSH分别提高7.14%、17.95%、11.38%,MDA降低25%,辣木提取物可清除链脲佐菌素诱导的氧化应激。Lamou等[50]研究辣木水提物对雄性wistar大鼠的氧化应激参数的影响,给予大鼠100、200、400 mg/kg的辣木叶水提物28 d,采用分光光度法测定大鼠肝脏和肌肉中抗氧化酶的活性,结果表明与空白对照组相比,不同浓度的辣木组大鼠肝脏及肌肉SOD、CAT、GPx均增加,且MDA值均降低。Ishola等[59]采用分光光度法研究辣木叶乙醇提取物对睾酮诱导的脂质过氧化大鼠的抗氧化作用,发现辣木提取物可减弱睾酮导致的MDA增加,GSH、SOD和CAT缺乏现象,增强机体抗氧化防御机制,该机制可能与辣木中的抗氧化活性成分清除睾酮诱导的自由基有关。

3 结论与展望

随着科技的进步和人类健康意识的提升,辣木作为药食同源、营养丰富的多年生乔木植物,得到广泛关注。辣木抗氧化成分主要为多糖类、多酚类及维生素类,其中辣木多糖具有抗氧化、抗病毒、降血糖等生理功能[60];辣木多酚具有抗氧化、抗炎、保护肝脏、降血压等药用价值[61];辣木中以VE和VC为代表的维生素类在临床上可由于防治感冒、机体氧化、衰老及老年性疾病[62]。辣木抗氧化成分主要受提取工艺、品种、采收时间和地点等因素影响,其中提取工艺中的方法、温度、溶剂等参数会影响相关化合物的结构和含量,进而影响辣木的抗氧化能力;而不同辣木品种间所含有的抗氧化成分和含量均有差异,采收时间和产地主要是对辣木中此类成分的含量造成影响。

虽有诸多学者对辣木抗氧化功能进行研究,并表明其具有良好的抗氧化能力,但多数是对辣木提取物的自由基清除作用、脂质过氧化抑制作用、抵抗氧胁迫作用进行评估,对于单体成分的抗氧化活性评估报道较少;同时,辣木的具体抗氧化作用机制并未明确阐述。因此,辣木抗氧化活性研究不应局限于体外化学试剂评估和体内抗氧化酶活性评估,还应深入到具体成分对机体的作用机制、药理活性、生物利用度等模型系统。在完善辣木抗氧化单体成分、体内抗氧化作用机制研究的基础上,应针对辣木抗氧化功效将其应用于功能性食品、饲料、化妆品等领域,此举不仅有望从食源角度辅助治疗氧化应激引发的衰老、神经萎缩、高血压、肿瘤等相关疾病,而且有利于推动辣木产业发展,为其精深加工提供创新途径。