重金属镉在鲫鱼鳃组织中的积累及其对P-糖蛋白基因表达的影响

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(1.华中农业大学食品科学技术学院,湖北武汉 430070;2.环境食品学教育部重点实验室,湖北武汉 430070)

随着工业的发展,人类工业活动例如电镀、采矿、冶炼等,导致大量Cd随废水排放及地表径流进入水生生态环境中,重金属Cd的污染问题日益严重[1-2]。Cd具有极强的蓄积性和毒性,是生物体非必需的重金属元素,若被动物摄食,可以通过食物链的逐级传递和富集,进而引起人体各种急性、慢性的毒性作用,最后对人类的健康造成威胁[3-4]。蓄积在动物和人体内的Cd会造成生殖系统功能障碍、损害结缔组织和肾、致癌和致畸等,甚至影响儿童的生长和智力发育,因此,镉污染已经受到越来越多人的关注[5-6]。

水生生物的多型异源物质抗性机制(Multi-xenobiotic resistance,MXR),是一种通过将内源和外源物质排出细胞,从而避免机体和细胞伤害的转运系统,类似于哺乳动物的多药抗性机制(Multi-drug resistance,MDR)。多种不同的转运蛋白组成MXR,其中P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)起到了非常重要的作用。它属于ABC转运蛋白超家族,是Mdr1基因编码的跨膜蛋白。P-gp是一类能量依赖性的外排泵,可以通过水解ATP,参与到药物和内、外源毒素的吸收、分布和排泄中,起到防御保护和解毒的作用[7-8]。有研究表明P-gp在重金属离子的吸收、积累和排泄中起重要作用,Achard等[9]的研究表明,当河蚬暴露于重金属Cd、Hg、Zn、Cu等时,P-gp的表达量显著提高,且其基因表达量随鳃组织中重金属富集浓度的增加而增加,与水体和鳃组织中重金属浓度呈现明显的剂量-效应关系。

鲫鱼肉质细嫩、味道鲜美,具有很高的营养价值,深受广大消费者的喜爱。鲫鱼在水生生态系统食物链中具有非常重要的位置,其对水环境中物理、化学和生物因素等变化反应十分灵敏,因而在毒理学和评价生态风险中表现出非常重要的实用价值[10-11]。本文以鲫鱼作为实验动物,对其鳃组织中Cd的累积情况、P-gp活性以及mRNA表达的变化进行探究,分析P-gp在鲫鱼体内耐受重金属Cd机制中的作用,分析重金属Cd累积与P-gp活性及其基因表达的相关性,旨在为研究鱼类对重金属的耐受和抗性机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲫鱼 平均体长为(17±2) cm,平均体重为(80±15) g,武汉某淡水鱼养殖基地;动物组织/细胞总RNA快速提取试剂盒、Reverse Transcriptase Kit(M-MLV)、2×HSYBR Green qPCR Mix 北京庄盟国际生物基因科技有限公司;维拉帕米(Verapamil,Ver) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯化镉、高氯酸、硝酸、罗丹明B(Rhodamine B,Rho B)等试剂 均为分析纯(AR),国药集团化学试剂有限公司。

AA240Duo型原子吸收光谱仪 美国安捷伦科技公司;F200 INFINITE型多功能酶标仪 瑞士帝肯Tecan公司;Qtower 2.2荧光定量PCR仪 德国耶拿公司;TCL-16高速冷冻离心机 湖南湘仪公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组、给药与取样 鲫鱼放于600 L的玻璃水箱内养殖,养殖用水为充分曝气的除氯后的自来水,在实验前驯养一周,以使它们适应实验室条件,整个养殖过程中增氧机连续充氧,采用半静态饲养法,用水pH(7.0±0.5),温度(23±1) ℃,溶氧量(6.8±0.7) mg/L,水硬度(133.4±2.0) mg/L(以CaCO3计)[12]。采用急性毒性试验,实验分为四组,一个对照组和三个实验组,对照组添加充分曝气、除氯后的自来水,实验组Cd2+低、中、高浓度2.12、4.23、8.46 mg/L。每组20尾鱼,分别在实验的0、24、48、72和96 h时,从各水箱中取出3尾鲫鱼,称重,测体长,取出鳃组织,用0.1 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液(PBS)冲洗后过滤称重,分别装入到1.5 mL塑料离心管中,作好标记后快速放入-80 ℃的超低温冰箱,以备后续实验。

1.2.2 鲫鱼鳃组织重金属Cd含量测定 采用国标GB 5009.15-2014《食品安全国家标准 食品中镉的测定》方法进行测定,具体称取样品1.00 g于锥形瓶中,加入9 mL硝酸和1 mL高氯酸浸泡过夜,在电热板上消化,变成棕黑色后,再加入硝酸消化至透明。冷却后将消化液转入10 mL容量瓶中,采用火焰原子吸收分光光度法测定Cd含量,测定参数为波长为228.8 nm,灯电流4 mA,燃烧器高度为6.5 mm,以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/L Cd标准溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标测出标准曲线,标准曲线方程为y=0.2241x+0.0011,决定系数R2=0.9997。

1.2.3 鲫鱼鳃组织中P-gp活性测定 以荧光染料Rho B作为底物,采用排出法测定P-gp活性。此外,使用66.7 μmol/L Ver作为抑制剂[13]。称取鳃组织100～140 mg放于8 mL浓度为5 μmol/L Rho B的除氯自来水中于黑暗条件下富集30 min。而后将鳃组织转移到等量除氯自来水中,冲洗三次,放回烧杯,加入8 mL除氯自来水预脱除10 min。预脱除后,各个鳃组织等分为2个平行样分别加入到10 mL除氯自来水:一组添加66.7 μmol/L Ver;另一组不添加抑制剂。轻轻震荡,每隔10 min各取200 μL反应液于96孔黑色酶标板内,第60 min取最后一次,多功能酶标仪测其荧光值,其中激发波长为535 nm,发射光波长为590 nm。根据测出的荧光值,以0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 pmol/L Rho B标准浓度为横坐标,荧光值为纵坐标测出标准曲线,标准曲线方程为y=121.09x+4734.9,决定系数R2=0.994,计算排除速率(pmol RhoB min-1g-1)[14-16]。

1.2.4 荧光定量PCR

1.2.4.1 引物设计 目的基因P-gp和内参基因GAPDH 的部分DNA 序列分别根据GenBank中发表的异育银鲫和鲤鱼的相应保守序列[17],采用Primer 5.0自行进行设计的引物,由武汉谷歌生物科技有限公司合成(见表1)。

1.2.4.2 鲫鱼鳃组织中总mRNA的提取 总mRNA的提取按照Animal tissue/Cell Total Kit进行,经1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,根据测定吸光度A260和A280的比值(数值应在1.8～2.1)检测RNA的纯度和浓度。

1.2.4.3 逆转录 以20 μL反应体系合成cDNA,按照Reverse Transcriptase Kit操作。逆转录后将得到cDNA置于-20 ℃冰箱内。

1.2.4.4 20 μL的PCR反应体系 加入2×SYBP qPCR Mix 10 μL;DNA Template 0.5 μL;Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μL;Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μL;ddH2O 8.7 μL。

1.2.4.5 P-gp荧光定量PCR反应条件 95 ℃预变性5 min;95 ℃变性5 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s共40个循环,在58～95 ℃之间制作熔解曲线;72 ℃再延伸10 min[18-19]。

1.2.4.6 相对定量的计算方法 进行相对定量时,检测样本中的特定mRNA时,需要以参比样本为基础,定量测定结果由靶mRNA/内参mRNA 的比值来表示,采用比较阈值法(2-ΔΔCt法)进行相对定量。以对照组设置为1,得到目的基因的相对表达量[20-21]。

相对表达量(relative quantification)=2-ΔΔCt=2-[(实验组P-gp Ct-实验组GAPDH Ct)-(对照组P-gpCt-对照组GAPDH Ct)]

1.3 数据处理

实验中每个处理重复三次,采用SPASS 19.0统计分析软件进行数据分析,应用Graphpad Prism 5软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 鲫鱼鳃组织中Cd蓄积量的变化

分别测定了不同Cd浓度2.12、4.23、8.46 mg/L和不同暴露时间24、48、72和96 h下鲫鱼鳃组织中Cd的含量,结果见图1。由图1可以看出,鲫鱼对Cd有非常强的富集能力,且能在鳃内快速富集,这一结果与之前学者研究结果相似[22]。本实验结果还发现不同Cd浓度和时间处理均对Cd在鲫鱼鳃组织中的蓄积有显著的影响(P<0.05)。暴露于4.23和8.46 mg/L Cd后,96 h内,Cd的含量随时间的延长呈上升趋势,说明过高含量的Cd已经影响了鲫鱼自身的防御机制,机体对Cd的摄入量远高于排除量,造成Cd的不断蓄积。暴露于2.12 mg/L Cd后,Cd的含量在48 h达到最大值,之后有所降低,说明在48 h后,鲫鱼体内的自身防御解毒机制起到了非常重要的作用,使Cd的含量不会大幅度增长[15]。且在整个试验期间,鲫鱼生长状态良好。综上所述,鲫鱼对Cd有一定的耐受能力,并且在耐受范围内能将Cd排出体外。此外,鲫鱼对不同重金属的敏感性、累积能力和排出情况不同,杨丽华[23]研究发现在4种重金属Cu、Zn、Cd和Cr中,Cu对鲫鱼的致死毒性最大,毒性大小依次为:Cu>Cd>Zn>Cr。

图1 不同Cd浓度和时间处理下鲫鱼鳃内Cd富集量Fig.1 Accumulation of Cd in gills of Carassius auratus at different concentrations of Cd and time注:不同字母代表同一时间差异显著(P<0.05)。图2～图4同。

2.2 暴露于Cd后对鲫鱼鳃组织P-gp活性变化

排出法测定P-gp活性时,其活性越高,在一定时间内排出的Rho B也越多,因此P-gp的活性变化用Rho B排除速率来间接衡量。在P-gp转运活性测定中,由图2可以看出,不同Cd浓度处理和不同Cd时间处理均对鲫鱼鳃组织P-gp活性变化有明显影响,这一结果与其他学者的研究结果相似。Ivanina等[13]在研究重金属Cd对美洲牡蛎鳃组织中P-gp活性时发现,牡蛎暴露于50 μg/L的Cd,在30～40 d后,Rho B的排除速率是对照组的3.5倍以上。本试验在24 h时,对照组和暴露于2.12 mg/L Cd,Rho B排出速率接近,是由于Cd处理时间短和Cd暴露浓度较低,鲫鱼鳃内Cd含量低,其P-gp的活性也低。72 h时,不同Cd浓度处理Rho B排出速率均达到最大,分别达到了Cd处理前的2.27、2.62、2.77倍,P-gp活性显著升高(P<0.05),表明鲫鱼暴露于Cd后,能提高鳃中P-gp活性,增强体内对Cd的排出能力,减少Cd的累积[24],继而说明P-gp对于鲫鱼耐受Cd发挥着重要的作用。96 h时,P-gp活性下降趋于稳定,表明长时间暴露于Cd之后,已经影响了鲫鱼自身的生理机能,导致P-gp的转运活性降低。

图2 不同Cd浓度和时间处理下鲫鱼鳃内P-gp活性的变化Fig.2 Changes of P-gp activity in gill ofCarassius auratus at different concentrations of Cd and time

2.3 P-gp抑制剂Ver对鲫鱼鳃组织P-gp活性的影响

图3 暴露于Cd后添加Ver对鲫鱼鳃组织P-gp活性的影响Fig.3 P-gp activity in gill of Carassius auratus after exposed to Cd with Ver

当向体外鲫鱼鳃组织加入终浓度66.7 μmol/L的P-gp抑制剂Ver后,其结果见图3,鲫鱼鳃组织中P-gp的活性显著低于未加抑制剂的实验组(P<0.05),使得Rho B排除速率下降。刘望鹏[14]研究P-gp在近江牡蛎耐受腹泻性贝毒DSP时发现,在加入P-gp抑制剂环孢菌素A和Ver后,其鳃组织中P-gp的活性显著低于未加抑制剂的实验组(P<0.05)。本研究以Cd处理浓度2.12、4.23和8.46 mg/L暴露24 h为例,在加入Ver后,鳃对Rho B的排出速率由不加Ver的 76.15、135.88和149.90 pmol Rho B min-1·g-1分别降低为57.44、90.021和72.64 pmol Rho B min-1·g-1,分别降低了24%、33%和51%,统计学分析两者之间差异显著(P<0.05),表明Ver能有效抑制鲫鱼鳃组织中P-gp的活性。因为P-gp是依赖于的ATP的外排泵,Ver能竞争性地与P-gp结合,抑制与P-gp偶联的ATPas活性,从而使得Rho B排除速率降低[25],表明P-gp在MXR中发挥着非常重要的作用,进一步反映出MXR鲫鱼在耐受Cd中所发挥的作用。

2.4 暴露于Cd后对鲫鱼鳃组织P-gp基因表达的影响

图4可以看出,整个实验过程中,鲫鱼鳃组织在暴露于Cd后P-gp的基因表达明显上调,且高浓度和中浓度组中P-gp的mRNA表达量高于低浓度组,这是因为P-gp是诱导蛋白。研究表明,自然界中存在的污染因子如毒素、重金属、马桑内醋等物质可以诱导机体中P-gp蛋白的表达[26-27]。Ren等[19]研究表明,吡硫锌可以诱导鲫鱼肝脏和肾脏组织中P-gp基因表达。胡鲲等[28]荧光定量结果表明,恩诺沙星在低残留阶段,实验组肠道和肝脏中P-gp的m RNA相对表达量与对照组无显著性差异;在高残留阶段,实验组肠道和肝脏中P-gp的m RNA相对表达量显著升高。本实验表明,不同Cd浓度处理在72 h时,鲫鱼鳃组织中P-gp的基因表达水平均达到最高,且与对照组有显著差异(P<0.05),分别达到对照组的1.54、2.88和3.61倍。随后,P-gp的基因表达水平并没有随着Cd积累量的增加而继续升高,而是出现了较大幅度的降低,这可能是鲫鱼对于重金属Cd存在其他的抗性机制,也有可能是由于鲫鱼长时间处于毒性环境中破坏其内环境的稳定、影响其正常生理功能,使得P-gp基因表达水平降低[25]。P-gp基因表达变化趋势和活性变化基本相对应,因此其在mRNA水平的表达可能在鲫鱼耐受重金属Cd中也发挥着重要的作用。

图4 不同Cd浓度和时间处理下鲫鱼鳃内P-gp基因表达的变化Fig.4 Changes of P-gp gene expression in gill ofCarassius auratus at different concentrations of Cd and time

3 结论

本文研究中发现了鲫鱼在暴露于重金属Cd后,Cd会在鲫鱼鳃组织内快速累积。同时,鲫鱼鳃组织中的P-gp活性和P-gp基因mRNA水平快速提高。P-gp活性的增加可使鲫鱼排出Cd的能力增强,减少Cd在体内的积累,从而减轻外来有害物质对机体的侵害。但Cd处理后在鳃组织中积累量仍在持续增加,推测P-gp对重金属Cd可能有一定的转运限度,随染毒时间的延长,Cd在鳃内累积的浓度处于高水平且无法及时排出体外,鲫鱼内环境遭受一定的破坏,影响机体内正常的代谢。研究表明,鲫鱼鳃组织的P-gp活性和mRNA表达的变化可较敏感地反映水环境中重金属Cd,可作为监测水体中重金属的潜在生物标志物。