糙米多酚对淀粉消化酶的抑制作用及机理

黄克愁1,黄 澳1,黄奕瑜1,罗舜菁1,曾子聪1,戴涛涛1,罗舜芬

(1.南昌大学食品学院,食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047;2.赣南师范大学图书馆,江西赣州 341000)

糙米作为一种全谷物,含有丰富的植物化学物质,例如维生素、矿物质、酚类物质、纤维和一些其它活性物质,因具有潜在的保健作用而受到关注[1]。糙米中含有丰富的酚类物质,研究表明多酚具有抗氧化、抑菌、抑制淀粉消化酶活性等多种生理功能,是目前研究的热点[2]。

淀粉消化酶类主要包括α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶等,此类酶能从碳水化合物分子链非还原性末端依次切开α-l,4糖苷键,并能缓慢水解α-l,6糖苷键,最终将碳水化合物水解为葡萄糖单糖,利于食物的消化吸收,影响细胞表面复合糖质的形成[2]。淀粉消化酶抑制剂能有效抑制α-葡萄糖苷酶或α-淀粉酶的活性,延缓食物中碳水化合物的水解和消化,降低餐后血糖水平,从而达到改善糖尿病的目的[3-5]。Yang等[6]指出红米、黑米和紫米多酚对α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,且黑米多酚抑制作用最强,其半抑制浓度为(13.6±1.2) mg/mL。Rasouli等[7]通过分子模拟技术筛选出26种多酚,它们均能与淀粉消化酶发生相互作用,其中花青素、表儿茶素、槲皮素和丁香酸等13种多酚能显著抑制α-葡萄糖苷酶的活性,另外推断出儿茶素、山奈酚和天竺葵素是有效的α-淀粉酶抑制剂。Peng等[8]研究发现,多酚能够通过氢键和范德华力与α-葡萄糖苷酶活性位点的氨基酸残基结合,诱导酶的重排和构象变化,阻止底物进入，从而抑制酶的活性。尽管近年来有研究报道大米多酚对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用,但大部分为有色米多酚或者多酚标准品。糙米作为日常生活中最为普遍的全谷物,糙米多酚(brown rice polyphenols,BRP)对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用及机理的研究还鲜有报道。

本文将BRP经过提取和C18固相柱纯化后,利用液相色谱-质谱联用(UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS)分析BRP的主要成分,然后研究了BRP纯化物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并通过荧光光谱研究了BRP与消化酶之间的相互作用,从而为延缓碳水化合物的水解、改善餐后血糖提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

籼糙米 江西新龙粮油有限公司;α-葡萄糖苷酶(≥10 U/mg) Sigma-Aldrich公司,来源于酿酒酵母;α-淀粉酶(≥5 U/mg) Sigma-Aldrich公司,来源于猪胰腺;对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)(纯度>98.0%) Solarbio公司;阿卡波糖片拜唐苹 当地药店;所有分离用有机溶剂 均为国产分析纯。

F-7000型日立荧光分光光度计 日本Hitachi公司;LC-30超高效液相色谱仪 日本岛津公司;TripleTOF 5600+质谱仪 美国AB Sciex公司;TU-1810紫外-可见分光光度计 北京普析有限公司;Multiskan MK3多功能酶标仪 美国Thermo Fisher科技公司;FreeZone 12-Plus冷冻干燥机 美国Labconco公司;Anke LXJ-IIB TGL-16C离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 BRP的提取纯化 提取:参照Tian等[9]的方法,并做适当的修改。取适量粉碎后过60目筛的糙米粉,加入正己烷(1∶5,W/V)搅拌脱脂30 min,2500×g离心5 min去除上清液,沉淀重复脱脂2次。室温下向脱脂后的沉淀中加入70%乙醇(1∶5,W/V)搅拌提取,每次30 min,2500×g离心5 min,取上清液。上述提取操作重复两次,合并上清液,45 ℃旋蒸去除有机溶剂,此为BRP粗提液。

纯化:将上述BRP粗提液采用Sep-Pak® Vac 20 cc(5 g)C18固相萃取柱进行纯化,具体操作步骤如下:对C18固相萃取柱进行预处理,即采用20 mL甲醇冲洗以活化固相萃取柱,接着用40 mL去离子水对C18固相萃取柱进行冲洗以平衡固相萃取柱。进行上样操作,取10 mL BRP粗提液加入到平衡后的固相萃取柱中,并用40 mL甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶9,V/V)进行冲洗,以除去样品中的杂质。采用40 mL甲醇水溶液(甲醇∶水=8∶2,V/V)对固相萃取柱进行洗脱,弃去前2 mL洗脱液,收集剩余洗脱液,然后置于45 ℃下旋转蒸发,去除有机溶剂,即为BRP纯化液,将上述BRP纯化液置于4 ℃冰箱中,保存备用。

1.2.2 BRP组分鉴定 参照Zeng等[10]的方法,BRP的组分分析采用岛津LC-30超高效液相系统并配有二元泵和二极管阵列检测器。色谱分离在室温下进行,色谱柱采用Shim-pack GIST C18柱(75 mm×2.1 mm,2 μm),流动相由0.1%甲酸(溶剂A)和乙腈(溶剂B)组成,并按以下步骤进行梯度洗脱:0～2 min,10% B;2～15 min,10%～20% B;15～20 min,20%～30% B;20～38 min,30%～40% B;38～40 min,40%～100% B;40～50 min,100% B;50～50.1 min,100%～10% B;50.1～55 min,10% B。使用自动样器进样,进样量为10 μL,流速为0.3 mL/min。质谱分析采用配备有电喷雾电离源(ESI)的飞行时间质谱仪(TripleTOF 5600+,AB Sciex,USA)。主要操作参数设置如下:空气为载气,氮气用作雾化和辅助气,优化值分别设置为30、50和50 psi;离子源的温度为550 ℃;喷雾电压5 kV;去簇电压80 V;碰撞能(35±15) eV;电离模式为正离子模式;数据采集采用信息关联数据采集模式(IDA),并在m/z 50～1000范围内获得质谱信息,并用MasterView 1.0和PeakView 2.1软件(AB Sciex,USA)进行数据采集和处理。

1.2.3 淀粉消化酶抑制率实验

1.2.3.1α-淀粉酶抑制活性 参考刘杰超等[11]的方法,并进行优化。用PBS溶液将BRP配制成0.01～0.4 mg/mL溶液,并以阿卡波糖片为阳性对照,PBS溶液为阴性对照。取0.25 mLα-淀粉酶溶液加入25 mL比色管中,然后加入0.5 mL 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2和0.4 mg/mL的一系列的BRP溶液或阿卡波糖和PBS溶液,混合均匀后,37 ℃水浴10 min,然后加入0.5 mL 1%的淀粉溶液启动反应,37 ℃ 水浴中反应10 min后,加入1 mL DNS溶液,沸水浴中反应5 min,取出冷却后定容至10 mL,最后于540 nm处测定样品吸光值。试验重复3次,每次3个复管,抑制率按以下公式进行计算:

式中:A1为BRP和α-淀粉酶反应后的吸光度;A2为只加BRP反应后的吸光度;A3为只加酶和底物反应后的吸光度;A4为只加入底物反应后的吸光度。

1.2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性 参考Yang等[12]的方法,用PBS(0.1 mol/L,pH6.8)溶液将BRP和阿卡波糖片配制成0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00和2.00 mg/mL的一系列样品溶液。其中阿卡波糖片为阳性对照,PBS溶液为阴性对照。首先将50 μL BRP溶液、阳性对照和阴性对照分别加入96孔板中,然后加入100 μLα-葡萄糖苷酶(0.25 U/mL)混合。样品在25 ℃下摇床孵育10 min后,加入50 μL 4 mmol/L p-NPG底物启动反应,反应5 min,立即在405 nm处测定吸光度,计算抑制率。酶抑制试验重复3次,每次6个复孔。

式中:A1为BRP和α-葡萄糖苷酶反应后的吸光度;A2为只加BRP反应后的吸光度;A3为只加酶和底物反应后的吸光度;A4为只加入底物反应后的吸光度。

1.2.4 荧光光谱测定 参照Dong等[13]的研究方法,扫描波长为290～500 nm,激发波长为295 nm,狭缝宽度均为2.5 nm。在浓度为2.423×10-6mol/L的3.0 mLα-葡萄糖苷酶溶液中连续滴加浓度为0.5 mg/mL的BRP溶液(终浓度为16.67×10-3mg/mL),混匀,3 min后测量这些混合溶液的荧光强度。

1.3 数据处理

上述测定均重复3次,并采用SPSS 22.0和Origin 8.0软件对数据进行分析,实验结果以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 BRP的组分鉴定

提取得到的BRP经过纯化后,采用UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS对多酚组分进行分析,并将实验结果与现有研究和质谱数据库(Metlin和Massbank)中的信息进行匹配,对比保留时间以及MS/MS质谱图对多酚组分进行鉴定。其液相谱图如图1所示,对应的质谱鉴定信息如表1所示。结果表明,与大多数其它植物成分一样,糙米中的酚类化合物可以作为游离苷元或者糖苷形式存在,且后者在自然界中更为常见。然而,现有的关于糙米酚类鉴定的研究主要集中在游离苷元及其聚合物的分析,关于多酚糖苷的研究较少。本实验共鉴定了27种多酚化合物,包括2种酚酸酰胺、6种酚酸、4种酚酸糖苷、6种酚酸酯、1种酚醛和8种黄酮糖苷[14-19](表1)。

图1 BRP的高效液相色谱图(280 nm)Fig.1 UPLC chromatogram(280 nm)of phenolic extracts of brown rice

2.2 BRP对淀粉酶的抑制作用

图2为BRP和阿卡波糖分别对α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制作用效果图。由图2可知,BRP对α-淀粉酶无明显的抑制作用,而对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着BRP浓度的增加呈上升趋势,最高可达39.37%,说明BRP对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制能力,但BRP对α-葡萄糖苷酶的整体抑制效果均低于同浓度的阿卡波糖。

图2 BRP和阿卡波糖对α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of brown rice polyphenols andacarbose on α-amylase(A)andα-glucosidase(B)

BRP对淀粉消化酶的抑制作用主要与多酚的含量及其组成有关[19]。稻米中的多酚类物质主要集中在米糠中,有研究表明米糠中多酚含量是糙米的4～10倍[20-22],因此现有的研究大多为米糠提取物对消化酶的影响。Wu等[19]研究了不同品种米糠多酚提取物对淀粉消化酶的抑制活性,结果表明黑米、籼米和粳米米糠的多酚提取物中均含有丰富的槲皮素、芦丁等黄酮类物质,因此对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有较强的抑制作用。但Boue等[23]的研究发现,普通糙米米糠提取物对两种酶均无明显抑制作用,主要原因可能是不同品种米糠中多酚组成存在较大差异。

表1 BRP的组分鉴定Table 1 Components identification of BRP

有研究表明阿魏酸[24]、咖啡酸[25]和对香豆酸[26-27]等酚酸物质对α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用,本研究以全谷物糙米为研究对象,多酚组分分析结果表明,BRP中含有一定量的游离酚酸,因此表现出一定程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性(最高抑制率为39.37%)。此外,BRP中主要为酚酸和黄酮类的衍生物,且主要以C-糖苷和O-糖苷的形式存在,因此BRP对α-淀粉酶的抑制作用较小,这与Boue等[23]的研究结果一致。

2.3 BRP对α-葡萄糖苷酶的作用机制

为了研究BRP对α-葡萄糖苷酶抑制作用的作用机制,利用α-葡萄糖苷酶自身内源荧光作为探针,通过α-葡萄糖苷酶荧光强度的变化解释BRP对α-葡萄糖苷酶的作用机制。图3表示在298、304、310 K,pH6.8的条件下,随着BRP浓度的增加(a～k依次增大)内源荧光发射光谱的变化。从图3中可以看出,复合体系的最大发射波长为336 nm,随着BRP的不断加入,复合体系的荧光峰值强度逐渐降低,表明二者之间发生了相互作用,从而对α-葡萄糖苷酶的内源荧光产生了强烈的猝灭作用。

图3 不同浓度BRP对α-葡萄糖苷酶内源荧光的猝灭光谱图Fig.3 Quenching spectra of endogenous fluorescence of α-glucosidase with different concentrations of BRP

2.3.1α-葡萄糖苷酶荧光猝灭的类型 荧光猝灭机制通常可以分为3种:动态猝灭、静态猝灭和静动态混合猝灭[28]。动态猝灭是猝灭剂和荧光物质的激发态分子之间的相互作用过程,其作用过程遵循Stern-Volmer 方程:

式(1)

式中：F0和F分别代表加入BRP之前和加入之后α-葡萄糖苷酶的荧光强度;[Q]代表BRP的浓度;τ0(10-8s)是未添加BRP时荧光发色基团的寿命;KSV是Stern-Volmer猝灭常数;Kq为猝灭速率常数。

图4为不同温度下以F0/F-1对BRP浓度进行的曲线拟合图。由图4可知,F0/F-1与BRP的浓度呈良好的线性关系,表明BRP对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭是单一的静态猝灭或者动态猝灭。根据公式(1)可以求出三个不同温度下的荧光猝灭速率常数KSV分别是18.3、20.6和24.3 L·g-1,且随着温度的升高而增加,因此,BRP对α-葡萄糖苷酶的猝灭过程是由分子碰撞引起的动态猝灭,BRP可能与α-葡萄糖苷酶中的色氨酸基或酪氨酸基结合形成了某种具有特定结构的复合体系。

图4 不同温度下BRP对α-葡萄糖苷酶荧光猝灭的Stern-Volmer图Fig.4 Stern-Volmer quenching fluorescence of α-glucosidase by BRP at different temperatures

2.3.2 BRP与α-葡萄糖苷酶相互作用的热力学参数和作用力类型 BRP与α-葡萄糖苷酶的结合位点数可通过Lineweaver-Burk双倒数方程进行分析:

式(2)

式中:[Q]和[Pt]分别表示BRP和α-葡萄糖苷酶的总浓度;Ka表示结合常数;n表示α-葡萄糖苷酶分子的结合位点数。

表2 不同温度下BRP对α-葡萄糖苷酶的荧光猝灭常数KSV,结合常数Ka和相互作用的热力学参数Table 2 Quenching constants KSV,binding constants Ka and relative thermodynamic parameters of the BRP-α-glucosidase interaction at different temperatures

注:Ra是KSV值的相关系数;Rb是Ka值的相关系数。

BRP与α-葡萄糖苷酶的热力学参数可以通过以下公式计算:

式(3)

ΔG=ΔH-TΔT

式(4)

式中:Ka表示结合常数;T为温度(298、304、310 K);R为气体常数(8.314 J·mol-1·K-1)。

由表2中的数据可以看出,BRP与α-葡萄糖苷酶的结合常数较大,表明BRP与α-葡萄糖苷酶的结合能力较大,且随着温度的升高,结合常数略有升高,这可能是因为温度的升高导致复合物的稳定性升高,从而导致结合常数变大。此外,在不同温度下结合位点数n值均接近于1,这表明BRP与α-葡萄糖苷酶有一个或一类相对独立的结合位点。

通过热力学参数焓变ΔH和熵变ΔS的大小可以确定小分子与蛋白质之间的相互作用力,根据公式(3),以1/T为自变量，InKa为应变量,拟合曲线,根据斜率和截距求出焓值和熵值,再根据公式(4)算出吉布斯自由能,若ΔH>0,ΔS>0表明为疏水相互作用;ΔH<0,ΔS<0为范德华力和氢键;ΔH<0,ΔS>0表明为静电相互作用;若ΔG<0则表明结合过程是自发的。由表4可知,ΔH>0,ΔS>0,据此推测BRP和α-葡萄糖苷酶之间的相互作用主要是疏水相互作用,且ΔG<0,表明结合过程是由焓和熵驱动的自发过程。

3 结论

液相色谱-质谱联用鉴定结果表明BRP中含有1种酚醛、2种酚酸酰胺、4种酚酸糖苷、6种酚酸、6种酚酸酯和8种黄酮糖苷,这些多酚活性物质对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性(最高抑制率为39.37%),可能的原因是BRP中含有一定量的游离酚酸,它能与α-葡萄糖苷酶发生疏水相互作用,对α-葡萄糖苷酶的内源荧光具有动态猝灭作用;而BRP对α-淀粉酶无明显抑制作用,可能是因为BRP中主要为酚酸和黄酮类的衍生物,且以C-糖苷和O-糖苷的形式存在为主,因此BRP对α-淀粉酶的抑制作用较小。以上结果表明,BRP主要通过与α-葡萄糖苷酶发生疏水相互作用,抑制α-葡萄糖苷酶的活性,从而延缓碳水化合物的消化和水解。