海洋细菌GM-1-1菌株对白色念珠菌的抗菌作用机理初步研究

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(1.淮海工学院海洋学院,江苏连云港 222005;2.江苏耕耘化学有限公司,江苏连云港 222005)

白色念珠菌(Candidaalbicans)又称白假丝酵母菌,是一种寄生在人体皮肤、消化道、神经系统等的条件致病性真菌[1],是导致真菌感染的重要致病菌之一,也是重要的食源性致病菌[2]。近年来,白色念珠菌感染的发病率呈逐年上升趋势,临床上有效的抗白色念珠菌的药物非常有限。由于白色念珠菌的自身特性,容易在一些生物材料表面形成生物被膜,且生物被膜对大多数现有的抗真菌药物都表现出高度耐药性特点,给临床治疗带来较大困难[3]。因此,寻找新型抗白色念珠菌以及能够有效抗生物被膜的药物显得意义重大。

海洋作为一个复杂、开放、变化的生物有机系统,造就了生物类群的多样性[4]。海洋中的微生物包括细菌、真菌、放线菌及病毒等,提供地球近一半的初级生产力,能够影响气候变化[5],参与物质和能量循环[6]。海洋微生物及其代谢产物种类丰富,结构特异,已成为21世纪新型药物研究开发的热点[7-8]。其中,海洋细菌分布广、种类多,产生的活性物质多种多样、分子结构新颖独特,被广泛用于新药物的开发[9-10]。

芽孢杆菌(Bacillus)是自然界中种类多、分布广的优势微生物菌群,大多为非致病性、对人畜无害[11],很多种类具有较强的抑菌作用,能产生多种抗菌物质,具有繁殖能力强、耐热、耐酸碱等优点[12],许多学者从不同环境中分离筛选到多种具有不同抗菌作用的芽孢杆菌,广泛用于动植物病害的生物防治。不同种类和来源的芽孢杆菌可以产生不同的抗菌物质,具有不同的抗菌作用机理。已有的研究表明,芽孢杆菌可以产生脂肽类、肽类、磷脂类、细菌素等多种抗菌物质,有的还能产生挥发性的抑菌物质,具有抑制真菌菌丝生长、孢子萌发的作用[13]。其中脂肽类物质是多数芽孢杆菌产生的重要的具有抑菌作用的次级代谢产物,是很多芽孢杆菌发挥抑菌作用的主要机制。脂肽类物质由亲水的肽键和亲油的脂肪烃链两部分组成[14-15],通过疏水脂肪烃链和氨基酸作用于靶细胞的细胞膜,扰乱膜结构,使细胞膜受到损伤,最终抑制细胞生长或死亡[16]。也有学者认为,脂肽类抗菌物质吸附于细胞膜上,但不直接作用于细胞膜本身,而是穿过细胞膜,作用于细胞内的生物大分子,例如蛋白质和DNA分子等,最终导致敏感菌株死亡[17]。由于脂肽类物质的抑菌功能,还可以适量添加到食品中提高食品的新鲜程度,延长食品保质期,节约能源和粮食。

近年来,本课题组在对黄海海域的抗菌海洋微生物资源筛选研究中,分离得到了多个具有抗菌活性的海洋微生物优良菌株。发现一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1菌株及其无菌发酵液对白色念珠菌(Canidiaalbicans)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、葡萄白腐病菌(Coniothyriumdiplodiella)、小麦根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、番茄早疫病菌(Alternariasolania)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、苹果腐烂病菌(Valsamal)、斑点落叶病菌(Alternariaalternate)、小麦纹枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.cucumarimum)等多种病原菌具有强烈的抑制作用[18-19],且抗菌作用对紫外线、温度、光照、酸碱度和蛋白酶具有较强的稳定性[20],但有关该菌株对白色念珠菌的抑菌作用机理尚未见报道,本文采用扫描电镜法、MTT法、分光光度法初步探究海洋细菌GM-1-1菌株对白色念珠菌的抗菌作用机理,为该菌株的进一步研究和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海洋解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GM-1-1 本实验室从连云港海域中分离获得并保藏;白色念珠菌(Candidaalbicans) 南京便诊生物科技有限公司;RPMI1640液体培养基 AR,HyClone公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT) AR,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;无水乙醇、氢氧化钠、吐温80、二甲基亚砜、十二水合磷酸氢二钠 AR,南京化学试剂股份有限公司;盐酸、玉米糊精、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾 AR,国药集团化学试剂有限公司;牛肉膏 BR,北京奥博星生物技术有限责任公司。

JSM-6390LA扫描电子显微镜 日本电子株式会社;Ultrospec 3300 Pro核酸蛋白定量仪 通用电气医疗集团生命科学部;Tecan Infinite F50酶标仪 帝肯(上海)贸易有限公司;XS-212江南生物显微镜 南京向日葵光学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备 GM-1-1菌株和白色念珠菌活化培养基:PDA培养基;GM-1-1菌株种子培养基:蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、葡萄糖5 g/L,蒸馏水1000 mL;GM-1-1菌株发酵培养基:玉米糊精20 g/L,牛肉膏15 g/L,硫酸镁1.4 g/L;白色念珠菌种子培养基:PD培养基;白色念珠菌发酵培养基:沙氏液体培养基,葡萄糖40 g,蛋白胨10 g,蒸馏水1000 mL;YPD液体培养基(用于白色念珠菌生物被膜形成试验):葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母膏10 g,蒸馏水1000 mL。

1.2.2 GM-1-1无菌发酵液的制备 将斜面上培养24 h的GM-1-1菌株接种至装有60 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,28 ℃,180 r/min摇床振荡培养18 h,调整细胞浓度为108个/mL,作为种子液,按10%的接种量接入装有50 mL/250 mL发酵培养基的三角瓶中,28 ℃,220 r/min摇床培养28 h。发酵液在4 ℃、9000 r/min的条件下离心20 min,弃菌体,得无菌体的发酵液,备用。

1.2.3 GM-1-1无菌发酵液抗菌性质的初步探究 采用牛津杯法。取培养24 h细胞浓度为106个/mL白色念珠菌菌悬液200 μL,均匀涂布在直径9 cm的PDA平板上,在平板中央放置1个牛津杯,加入200 μL GM-1-1菌株无菌发酵液,28 ℃恒温培养36 h,十字交叉法测定抑菌圈的直径。在无菌操作条件下,用打孔器取抑菌圈内的培养基,表面朝下接种于新鲜PDA平板上,28 ℃恒温培养36 h,观察平板上是否有菌落长出。

1.2.4 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌孢子萌发的影响 1.5 mL EP管中加入培养24 h细胞浓度为105个/mL白色念珠菌菌悬液100 μL和等量的无菌发酵液充分混匀,再加入100 μL沙氏液体培养基,30 ℃下恒温培养,分别于1、2、3、4、5 h时取培养液于无菌载玻片上,观察孢子萌发的情况,计算孢子萌发率。

1.2.5 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌细胞形态的影响 采用扫描电镜法。取抑菌圈边缘内侧的白色念珠菌于扫描电镜下观察细胞形态,以正常状态培养下的白色念珠菌作为对照,比较处理组与对照组白色念珠菌菌体的细胞形态变化。

1.2.6 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成的影响

1.2.6.1 白色念珠菌生物被膜的培养 将白色念珠菌接种于YPD培养基中,35 ℃、180 r/min振荡培养18 h,离心收集菌体,用RPMI1640培养基稀释,调整菌液细胞浓度为1×106个/mL。取96孔细胞培养板,每孔加入100 μL菌液,37 ℃培养2 h,弃去培养基,用pH7.4、0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次,多孔板底部形成白色生物被膜。加入100 μL RPMI1640培养基,作为培养的0点。

1.2.6.2 白色念珠菌生物被膜的测定 采用MTT法。弃去多孔板中最后培养液,用PBS缓冲液轻轻洗去悬浮细胞,每孔加入100 μL PBS缓冲液及20 μL MTT,37 ℃孵育4 h后弃上清,每孔加入100 μL二甲基亚砜,振荡5 min,室温静置30 min后,用酶标仪测定OD492值[21]。每个处理4个孔,为4次重复。

1.2.6.3 不同浓度无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成的影响 在白色念珠菌生物被膜培养的0点,分别加入0%、5%、10%、20%、40%、60%、100%不同稀释度的GM-1-1发酵液,37 ℃继续培养48 h,弃去培养基,PBS洗涤3次,测定不同浓度GM-1-1发酵液处理的OD492值[22]。比较不同处理的OD值的大小,分析不同浓度无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成的影响。

1.2.6.4 无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成不同阶段的影响 分别在白色念珠菌生物被膜形成后的0、2、12、24、48、72 h时加入100 μL菌株GM-1-1发酵液,以等量的RPMI1640培养基为空白对照,37 ℃继续培养48 h。测定不同处理的OD492值。每个时间为一个处理,每个处理设4个重复。

1.2.7 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌细胞通透性的影响 将培养18 h的白色念珠菌菌悬液10000 r/min离心20 min收集菌体,PBS洗涤三次。用含0.001% Tween80的PBS悬浮细胞,菌体细胞浓度调至109个/mL。向悬浮细胞中加入1.5 mL GM-1-1无菌发酵液,以等量的无菌水为对照,37 ℃、180 r/min培养,分别于0、1、2、4、6 h取样,4 ℃、10000 r/min离心,测定上清液OD260值。

1.3 数据处理

Excel和Origin 7.0进行数据的处理与分析。

2 结果与分析

2.1 GM-1-1无菌发酵液抗菌性质初步探究

从图1可以看到,牛津杯周围出现了清晰的抑菌圈,抑菌圈直径达39.5 mm,表明GM-1-1菌株无菌发酵液对白色念珠菌具有强烈的抑制作用。

图1 无菌发酵液对白色念珠菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of sterile fermentation broth on Candida albicans

取透明圈中央的琼脂块接种到新的PDA平板上,培养36 h后平板上长出了白色念珠菌菌落,说明GM-1-1无菌发酵液处理后的白色念珠菌并未死亡,在转移至不含无菌发酵液的PDA培养基上后可继续繁殖形成菌落,初步认为GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌的繁殖具有抑制作用,处理后的白色念珠菌不能形成新的细胞,但不能杀死已经形成的细胞。

2.2 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌孢子萌发的影响

如图2,用无菌发酵液处理白色念珠菌的孢子后,活的孢子能够发育形成菌落,而死孢子仍为单个细胞。由图3可知,对照组白色念珠菌的孢子萌发率随时间增加迅速提高,5 h时白色念珠菌孢子的萌发率达到92.44%;而GM-1-1菌株无菌发酵液处理的白色念珠菌孢子萌发率低,5 h时孢子的萌发率仅为34.22%,明显低于对照组,说明GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌孢子的萌发具有较强的抑制作用。

图2 5 h时白色念珠菌孢子萌发情况(400×)Fig.2 Spore germination of Candida albicans at 5 h(400×)

图3 无菌发酵液对白色念珠菌孢子萌发的影响Fig.3 Effect of sterile fermentation broth on spore germination of Candida albicans

2.3 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌细胞形态的影响

在扫描电子显微镜下观察无菌发酵液处理的白色念珠菌以及正常生长的细胞形态发现,无菌发酵液处理后的白色念珠菌细胞表面出现明显凹陷,凹陷大小不一,细胞壁残缺,细胞上出现破洞,菌体出现不规则形态(图4B);未处理的白色念珠菌菌体细胞完整光滑,形态规则、饱满(图4A)。说明无菌发酵液对白色念珠菌的细胞形态具有较强的破坏作用。该结果与刘全永等[23]通过扫描电镜观察分离自海水的凝结芽孢杆菌黑石礁亚种LU-B02菌株发酵液对白色念珠菌细胞形态影响的结果一致。

图4 无菌发酵液对白色念珠菌细胞形态的影响Fig.4 Effect of sterile fermentation broth on cell morphology of Candida albicans

2.4 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成的影响

2.4.1 不同浓度无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成的影响 由图5可知,GM-1-1菌株无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜的形成影响较为明显,在供试发酵液的浓度范围内,OD492值均显著低于对照(P<0.05);且随着发酵液浓度的增加,OD492值越低,但不同浓度处理的OD492值差异不显著(P>0.05)。对比谈潘莉等[22]采用XTT法评价黄根醇提取物对白色念珠菌生物被膜形成实验结果,随着浓度的增加,黄根醇提取物对白色念珠菌生物被膜的抑制作用增强,呈正相关关系,与本实验结果具有相同的变化趋势。

图5 不同浓度的无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成的影响Fig.5 Effect of different concentrations of sterile fermentation broth on the biofilm formation of Candida albicans注:不同小写字母代表差异性显著(P<0.05),图6、图7同。

2.4.2 无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成不同阶段的影响 无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜的形成具有明显的抑制作用,不同时间点的抑制率不同，结果如图6。0和2 h无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜的抑制作用较强,抑制率分别为89.01%和86.06%,二者差异不显著(P>0.05);2 h后抑制率明显下降,不同时间的抑制率均显著低于0和2 h(P<0.05)。Chandra等[24]将白色念珠菌生物被膜的形成分为3个阶段:早期(0～11 h),中期(12～30 h)和成熟期(38～72 h)。早期的黏附尤为重要,随着培养时间的延长,生物被膜逐渐发育成熟,抑制黏附是抗白色念珠菌生物被膜感染的关键措施[22]。

图6 无菌发酵液对白色念珠菌生物被膜形成不同阶段的影响Fig.6 Effect of sterile fermentation broth on different stages of Candida albicans biofilm formation

2.5 GM-1-1无菌发酵液对白色念珠菌细胞通透性的影响

如图7所示,在1～6 h范围内,处理组的OD260值均高于对照组,随着培养时间的增长,对照组与处理组OD值的差异越来越大,达到显著水平(P<0.05)。培养时间为6 h时,对照组的OD260值为0.506,而处理组的OD260值为0.697,明显高于对照组,表明无菌发酵液对白色念珠菌的细胞通透具有一定的影响。孟松[25]将从藠头中分离出的活性物质作用于白色念珠菌,细胞通透性试验结果表明，藠头活性物质导致白色念珠菌OD260特征吸收值物质的泄露,破坏了细胞的通透性,导致细胞活力下降甚至死亡。

图7 无菌发酵液对白色念珠菌细胞通透性的影响Fig.7 Effect of sterile fermentation broth on the permeability of Candida albicans cells

3 结论

本文以白色念珠菌为指示菌,初步探讨了GM-1-1菌株无菌发酵液对白色念珠菌的抗菌性质及其抗菌作用机理。实验结果表明，GM-1-1菌株无菌发酵液能明显抑制白色念珠菌的生长和繁殖，抑菌圈直径达39.5 mm,对孢子萌发具有强烈的抑制作用，GM-1-1菌株无菌发酵液处理5 h时孢子萌发率仅为34.22%;能够破坏白色念珠菌的细胞形态;抑制白色念珠菌生物被膜的形成；破坏了细胞的通透性。本试验结果为该菌株的进一步开发和研究奠定了一定的理论基础。