低剂量电离辐射对Ⅰ型糖尿病大鼠海马神经元细胞凋亡和氧化损伤的影响

刘 飞，郭 伟,王志成*

(1.武警吉林总队医院第二门诊部,吉林 长春130052；2.吉林大学公共卫生学院国家卫健委放射生物学重点实验室，吉林 长春130021)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成为继心血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害居民健康的重要慢性代谢性疾病，本研究通过链尿佐菌素(STZ)药物诱导Wistar大鼠的糖尿病模型，进而给予低剂量电离辐射(LOR)，探讨其抗氧化活性和降低凋亡的作用，为糖尿病脑损伤的保护提供新思路和实验数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

STZ及DCFH-DA(2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate)购自美国Sigma公司；血糖仪及配套试纸购自美国强生公司；AnnexinⅤ/FITC试剂盒购自美国BD公司；MDA、SOD和CAT试剂盒购自南京建成生物研究院；β-actin、Bcl-2、Bax和caspase-3一抗购自美国CST公司；X-RAD 320iX生物辐照仪购自美国Precision X-ray公司；紫外分光光度计购自美国Bio-Tek公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验动物

Wistar大鼠购自吉林大学白求恩医学部实验动物中心，动物合格证号：SXCK(吉)203-2007，实验前大鼠室内适应环境一周，自由进水、进食，60只雄性大鼠进行造模，造模成功大鼠进行分组。

1.3 STZ诱导糖尿病模型

造模前大鼠禁食12 h，不禁水，造模时按照50 mg/kg进行STZ(10 g/L)左下腹腔一次性注射，注射2 d后检测空腹12 h尿糖，取尿糖“+++”者再次注射STZ，3 d后取尾静脉血测空腹12 h血糖，血糖大于16.7 mmol/L，且具有多饮、多食、多尿现象，确定为糖尿病模型。

1.4 实验分组及处理

正常大鼠10只，以及造模成功的糖尿病大鼠40只，分成正常组、模型组、模型+25 mGy、模型+50 mGy和模型+75 mGy组，每组10只。LDR照射剂量率为12.5 mGy/min，电压180 kV，电流15 mA，隔日照射，照射12次，继续实验4周。

1.5 生化法检测MDA、SOD和CAT

LDR照射后4周，麻醉后处死大鼠，冰上取出大脑，轻轻剥离海马，每组4只大鼠的海马在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，放入玻璃离心管中，并加入9倍体积的冷匀浆介质，用组织剪将其剪碎，超声粉碎仪将组织匀浆后分装在EP管中，制备好的10%海马组织匀浆，测定蛋白浓度。分别采用MDA、SOD和CAT试剂盒检测MDA含量、SOD和CAT活力。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡和ROS

3只大鼠海马放置5 ml 0.01 M PBS中，利用毛玻璃轻轻研磨成单细胞悬液，并经200目尼龙网过滤，1 500 rpm离心5 min后，计数，定容后待测。每组取5×105个细胞，加入450 μl Buffer，2 μl的Annexin V和5 μl的PI；室温避光染色15 min，流式细胞术检测凋亡；另取1 × 106个细胞，加入40 μl(20 mmol/L)的DCFH-DA，37℃孵育30 min；PBS洗2次后1500 r/min离心5 min，流式细胞术检测ROS水平；Cell Quest 软件分析结果，并以百分率表示。

1.7 Western blot检测Bcl-2、Bax和caspase-3的表达

此处引用的是《诗经·桃夭》的内容，是一首祝贺年轻姑娘出嫁的诗。这是前半夜唱的叙旧歌，表达姑娘对美好爱情与幸福婚姻的憧憬，想得到一个如意之人。

每组3只大鼠的海马，提取总蛋白并进行定量，蛋白变性后每组取25 μg上样，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，浓缩胶采用60 V恒压，分离胶采用120 V恒压。蛋白转膜至硝酸纤维膜后，利用新鲜配置的封闭液(1×TBST,5%脱脂奶粉，0.05%的Tween-20)常温封闭1 h，分别按照1∶1000(β-actin)和1∶500(Bcl-2、Bax和caspase-3)进行一抗孵育，4℃过夜，用含0.05% Tween-20的TBST洗3次，每次10 min，继而按照1∶1000的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃震荡孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，利用ECL发光试剂盒进行发光，X线片曝光显影，照相后分析蛋白的表达。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 LDR对大鼠血糖水平的影响

造模成功后未进行LDR前，DM和DM+LDR组大鼠血糖水平均高于16.7 mmol/L，且各组间无明显差异，表明模型为糖尿病模型，可以用于后续研究(表1)。给予25、50和75 mGy照射后2周，血糖继续增加，且显著高于Control组(P<0.05)，各剂量组间无显著差异；照射后4周，DM组血糖水平升高到25.33 mmol/L，LDR各组均显著低于DM组(P<0.05，表1)；而LDR照射结束后4周，DM组血糖仍维持在高水平，25、50和75 mGy照射组血糖均有下降趋势，且以75 mGy降低最多。

表1 各组大鼠血糖水平

注：*P<0.05 vs Control group，#P<0.05 vs DM group

2.2 LDR对大鼠海马神经元细胞氧化损伤的影响

模型大鼠经LDR后4周，检测海马神经元细胞ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力，结果显示，与Control组比较，DM组ROS水平和MDA含量显著升高(P<0.05，表2)，而SOD和CAT活力未见明显改变；而给予25、50和75 mGy LDR后，ROS水平和MDA含量则较DM组显著降低(P<0.05，表2)，且SOD和CAT活力仍处于较低水平(P<0.05，表2)。

表2 各组Wistar大鼠经LDR后ROS水平、MDA含量、SOD和CAT活力

注：*P<0.05 vs Control group，#P<0.05 vs DM group

2.3 LDR对模型大鼠海马神经细胞凋亡百分比的影响

流式细胞术结果显示(图1)：海马神经细胞凋亡百分比Control组为(6.85±0.75)%、DM组为(28.51±2.47)、DM+25 mGy组为(18.56±2.66)%、DM+50 mGy组(14.83±1.59)%和DM+75 mGy组为为(13.88±2.98)%；与Control组比较，DM和DM+LDR组凋亡百分比均显著增加(P<0.05)，与DM组比较DM+LDR组凋亡百分比则显著降低(P<0.05)。

2.4 LDR对大鼠海马神经元细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表达的影响

模型大鼠经LDR后4周，检测海马神经元细胞中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表达，由图2可见，DM模型组Bcl-2表达降低，而Bax和caspase-3均增加，暗示凋亡的增加；而DM大鼠经LDR后Bcl-2表达增加，而Bax和caspase-3表达则降低，暗示LDR降低了DM大鼠海马神经元细胞的凋亡，与流式结果相似。

图1 利用AnnexinⅤ/FITC试剂盒流式细胞术检测Wistar大鼠海马神经元细胞的凋亡

图2 Western blot检测Wistar大鼠海马神经元细胞Bcl-2、Bax和caspase-3的表达

3 讨论

STZ诱导的糖尿病模型大鼠高血糖在大脑各个区域神经的降解起到重要作用，包括扣带回皮质、丘脑核和海马体，主要和ROS的产生有关[1]。海马体对近期主要记忆具有重要作用，并将其存入大脑皮层转变成永久记忆。海马体在记忆和学习中的重要作用已经得到充分的认识，海马受损的患者记忆力明显下降，并可能患有焦虑症。研究表明，糖尿病时葡萄糖对神经的毒性作用也是因为增强细胞内葡萄糖的氧化进而导致ROS产生的增加[2]。在本研究的动物模型中，海马神经元细胞ROS水平和MDA含量均显著高于正常组，暗示糖尿病模型处于氧化损伤状态。另外，氧化应激损伤细胞可以诱导凋亡，研究表明糖尿病时海马细胞由高血糖诱导的凋亡是海马损伤的一个重要途径[3,4]。而且在凋亡过程中，凋亡的线粒体调控途径涉及到持续的高血糖状态可以产生过量的ROS，使得线粒体膜电位及渗透性发生变化，膜通透性转运孔开放，膜去极化，使得线粒体内促凋亡因子释放到细胞浆中，激活caspase-3，引发级联反应，从而诱发凋亡；另外，Bcl-2/Bax对于调控膜的通透性具有重要的作用[5]。本研究所构建的糖尿病大鼠模型中，海马神经细胞凋亡显著增加，且Bcl-2表达降低、Bax和caspase-3表达增高，暗示相应的线粒体通路被激活。

长期的高血糖会导致严重的并发症，针对性治疗可以有效缓解相应的并发症。研究者利用番茄红素(lycopene)治疗糖尿病大鼠模型，结果显示可以降低氧化损伤，并且降低氧化应激导致的外周炎症和认知损伤的发展，而且也能降低线粒体途径介导的细胞凋亡[6,7]。由此可见，以降低氧化损伤为目的的糖尿病神经损伤将具有重要的意义。低剂量电离辐射是单次照射剂量小于0.2 Gy，剂量率控制在0.05 Gy/min以内的剂量[8]。以往研究显示可通过诱导抗氧化活性对大脑进行保护作用，且LDR对大脑不具有损伤效应[9,10]。在本研究中，25、50和75 mGy的LDR对糖尿病模型大鼠的血糖具有一定的控制作用，但并未达到完全逆转的效果。而且，也降低DM大鼠海马ROS水平和MDA含量，暗示可以降低氧化损伤，未能显著提高抗氧化能力。同时，也降低了DM大鼠海马神经元细胞凋亡和线粒体途径相关分子的表达。由此可见，LDR可以通过降低氧化损伤、抑制凋亡的诱导，从而发挥控制血糖的作用，有可能是一个较好的糖尿病脑并发症控制的新思路。

总之，本研究通过STZ建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型，并给予LDR照射治疗，结果显示糖尿病大鼠海马的氧化损伤和凋亡诱导增加，且LDR具有一定的缓解作用，这为LDR控制糖尿病脑损伤的研究提供了必要的实验证据。