慢性房颤犬脂肪垫Notch-1表达变化

班努·库肯，买力旦木·艾克拜，钟小兰*

(新疆医科大学第二附属医院 1.心内科;2.心电图室，新疆 乌鲁木齐830028)

心房颤动(简称房颤)是临床上最常见的快速心律失常，60岁以上人群中发生率高达1%，并且有很高的致残率和致死率[1]。虽然房颤病因和发生机制的研究已经取得了较大进展，治疗却依然令人棘手。心脏内源性自主神经系统主要由位于心脏表面、大血管附近的神经节丛以及连接神经丛的神经纤维互相连接构成。内源性自主神经系统的活性增高能够极大地改变心房肌细胞的电生理特征，可增加房颤诱发的几率，其中脂肪垫神经丛在房颤的发生和维持中具有重要意义。Notch信号通路是一个高度保守的信号系统，在心血管发育等生理、病理过程中有重要的作用。Notch有4个Notch同源基(Notch1-4)和5个配体，Notch与配体 Jagged /Delta结合后，形 成 NICD进入细胞核，与RBP-Jκ结合一起激活下游靶基因Hes、Hey等靶基因的转录[2]。 Notch的激活与表达变化是否是房颤电重构和神经重构中的一种普遍参与机制至今未见相关报道。本项目拟基于慢性起搏犬左心房致房颤模型的建立，研究慢性房颤犬窦房结脂肪垫(Sinoatrial node fat pad，SAN-FP)神经丛中Notch-1蛋白表达变化及Notch-1、NICD含量变化，进一步阐明SAN-FP神经丛Notch信号通路与房颤的发生发展有密切关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1研究对象 健康比格犬，体重18±2.66 kg，年龄7-9岁，雌雄不拘。动物质量属于一级标准。实验设计及实施均经过动物伦理委员会的审核批准。

1.1.2实验动物分组 实验动物随机分为2组，假手术组(n=5)：行微创开胸术，但不植入起搏器。房颤组(n=5)：微创开胸术，左心耳植入起搏器起搏8W。

1.2 实验方法

1.2.1持续快速心房起搏(rapid atrial pacing，RAP)犬致房颤模型制作

术前动物禁食水12 h。常规消毒手术器械、手术服及手术环境。严格按照无菌技术要求操作。盐酸氯胺酮注射液(20 mg/kg)肌肉注射基础麻醉后，待犬的状况稳定后行气管插管，呼吸机辅助呼吸，调节氧流量4-6 L/min，潮气量为20 mL/kg，呼吸压力0-2 Kpa。应用LEAD-2000多道电生理记录仪动态记录犬正常II导联心电图。犬右侧卧位，左侧胸部剪除犬毛，用碘酒、酒精消毒切口后，应用微创心脏外科技术作左腋下小切口，长约5-7 cm左右，以4-5肋的肋间隙为切口，逐层切开皮肤、皮下肌层，用合适的开胸器撑开切口，逐层开胸打开心包，暴露左心耳，采用荷包缝合，将起搏电极缝合固定于左心耳的底部，起搏电极用人的心房翼状起搏电极，然后将电极尾端与实验用动物埋藏式高频心脏起搏器相连，将起搏器埋藏于胸部皮下囊袋内，逐层缝合肌肉及皮下组织、皮肤。无菌纱布包扎切口。观察犬的症状及体征。犬的一般情况稳定，伤口拆线后开启起搏器予以连续起搏8周。房颤定义为心房无序的电活动，心电图表现为P波消失，代之以大小不等间隔不均，形态不一的 f 波，频率 450-600次/分，RR间期不等，持续 10 s 以上。

脂肪垫定位：成年犬在术前12 h禁食，6 h禁饮，手术前洗澡。肌注氯胺酮(15 mg/kg)基础麻醉，然后以3%的戊巴比妥钠(20 mg/kg)静脉注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，分别在双后肢、双前肢和胸前刺入自制银质针头，按照标准连接心电图导线，动态记录体表导联心电图。气管插管后，剪除犬毛。取右侧位，沿左侧第4肋间剪开皮肤，分离皮下和肌肉组织，开胸器顺肋间横向撑开胸廓，切开心包制作心包吊篮，暴露心脏左心房和左上下肺静脉，在主动脉根部和上腔静脉中部之间可见一脂肪垫(SVC-Ao FP)，进行电生理测试之后将左侧切口缝合。取左侧卧位，沿右侧第4肋间剪开皮肤，分离皮下和肌肉组织，开胸器顺肋间横向撑开胸廓，制作心包吊篮，在左心房和右上肺静脉之间可见一脂肪垫(SAN- FP)。进行电生理测试之后将右侧切口缝合。电生理测试：使用自制电极刺激心脏神经丛的神经元。参数如下：刺激频率 20 Hz，脉冲持续时间 0.1 ms，刺激时间 50 ms，电压1.6-2.4 V。此高频刺激不会兴奋心房，当心率逐渐减慢达50%为脂肪垫所在位置。

1.2.2HE染色 (1)取2组SAN-FP组织切片烘片20分钟后，二甲苯20分钟，依次放入梯度乙醇中。(2)入苏木精液染色5分钟，加入1%盐酸乙醇液分化数秒钟，切片变红。自来水冲洗；(3)切片置入75%乙醇伊红液数秒钟后，放入梯度乙醇中数秒脱水；(4)滴加中性树胶于组织上，取清洁盖玻片覆盖，显微镜下观察组织像。

1.2.3免疫组化测定 两组实验犬SAN-FP石蜡包埋，切片。采用SP免疫组化染色法对Notch-1染色。阴性对照以PBS代替一抗，Notch-1着色表现为胞浆染成棕褐色为阳性结果，分别计算阳性细胞数。

1.2.4双抗体夹心法(ELISA)测定组织中Notch-1和NICD含量 用犬蛋白抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔板中依次加入犬心脏脂肪垫组织蛋白，再与HRP标记的蛋白抗体结合，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD)值，通过标准曲线计算样品中犬蛋白的浓度。

2 结果

2.1 模型制作完成情况手术完毕时及起搏8周后，房颤组制作犬慢性房颤模型成功率达到100%。起搏器开启后，经心电图检测，房颤组犬经快速起搏左心耳均可成功诱发房颤。

2.2 脂肪垫定位及组织学特点电极刺激心脏脂肪垫后，假手术组实验犬均未出现房颤，房颤组均出现房颤图形，如图1。将SAN-FP定位后行HE染色后可见脂肪细胞中散在分布的神经丛，如图2。

2.3 2组Notch-1表达变化假手术组SAN-FP蛋白表达呈深棕色，部分表达呈斑点分布在心脏表面神经元。房颤组SAN-FP蛋白表达呈深棕色。2组SAN-FP 蛋白阳性表达计数结果显示，假手术组有少量Notch-1蛋白表达。与假手术组比较，房颤组Notch-1蛋白表达显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；如图3和表1。

图1 房颤组犬SAN-FP刺激后电生理图

图2 SAN-FP的HE染色(×400) 图3 2组SAN-FP内Notch-1表达变化

表1 2组SAN-FP Notch-1蛋白阳性表达计数(个/视野，

注：与假手术组相比，*P<0.05。

2.4 2组SAN-FP内Notch-1和NICD含量变化与假手术组比较，房颤组基线水平Notch-1和NICD浓度差异无统计学意义(P>0.05)。实验8周后，与假手术组相比，房颤组Notch-1和NICD浓度显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；如表2。

3 讨论

心脏脂肪垫是一种具有调节器官生物活性的代谢器官，由于心外膜脂肪垫与心肌直接毗邻，且两者共用一套微循环系统，故心外膜脂肪垫产生的因子可以通过内分泌或旁分泌机制直接作用于心房肌，对心外膜脂肪垫进行干预将可调节心脏内在自主神经系统的活性。长期持续性房颤使心房和脂肪垫自主神经相关纤维、神经节、受体等空间分布和递质发生变化，促进局部心肌发生结构及神经重构，参与房颤发生或维持。Notch信号通路相关蛋白在心脏中均有表达，其过表达与缺乏均可造成心脏发育异常[3]。Notch 信号下游基因转录蛋白与心肌富含的心肌转录因子( GATA) 相结合，可抑制GATA介导的心肌基因转录，调节心脏基因的表达。GATA-4 直接影响心脏结构基因的表达，包括α-肌球蛋白重链、肌钙蛋白 C、心房利钠肽、脑利钠肽等，以及通过其锌指结构与其他心脏特异性的转录因子如 Nkx2-5、TBX5、胚胎成纤维细胞等相互作用形成复合物发挥转录调控作用[4，5]。有研究证明，Notch信号通路在促进受损后心肌保护和心肌再生中发挥重要作用[6]。Yang等[7]研究显示，在心肌缺血时Notch信号通路激活能够显著提高心脏收缩功能，减少梗死面积，抑制心肌细胞凋亡并促进新生血管的生成。同时研究证实，血管损伤后Notch受体和下游靶基因都会发生特征性的改变。Brandt等[8]研究显示，在血管损伤实验模型中，Notch信号通路中许多分子都发生了时序性改变，包括Notch1-3、Jagged1-2、Hey1-2。Gude等[9]研究显示，Notch信号通路相关蛋白在心脏中均有表达，其过表达与缺乏均可造成心脏发育异常。Li等[10]提出了Notch募集干细胞、促进新生血管形成及介导细胞进一步分化等机制。Gude NA[11]等研究认为Notch 信号途径对心肌细胞具有保护作用，该作用是 Notch/Hey上调磷酸化AKt的表达，激活了磷酸肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKt/PKB)传导途径而实现的。Notch1信号通过与Akt、ERK、NRG1-ErbB 等信号通路相互作用而在心肌缺血损伤和心肌保护中发挥重要作用。上述国内外资料显示，Notch信号通路在心肌缺血和新生血管形成、心功能改善等方面发挥保护作用，使人们开始认识到Notch信号通路可能参与了房颤的发生与维持。但在房颤发生中作用如何，干预其信号通路激活是否会产生抑制/启动房颤作用?目前国内外各种研究资料尚未有相关报道。本研究成功建立慢性房颤犬模型，结合电刺激SAN-FP定位，组织学切片显示SAN-FP由大量的脂肪细胞、散在分布的神经丛组成。免疫组化结果显示SAN-FP神经丛中可见Notch-1蛋白表达，房颤组SAN-FP内Notch-1显著表达，同时ELISA法显示SAN-FP内Notch-1和NICD含量明显升高，结果显示房颤发生发展过程中SAN-FP神经丛内Notch-1与配体结合后以NICD形式活化进而影响下游靶基因。同时Notch-1可能在房颤发生的不同时期表达，并受到SAN-FP内脂肪细胞因子和神经相关因子的调节，从而对心肌细胞的离子通道、功能蛋白分子发挥作用。

表2 2组Notch-1和NICD浓度变化

注 ：与基线水平比较，*P<0.05；与假手术组比较，#P<0.05。

Notch信号通路是高度保守的信号系统，通过Notch 配体与受体的相互作用而转导细胞间和细胞内信号，从而精确调控心肌细胞的分化，在心血管发育等生理、病理过程中有重要的作用。心外膜脂肪垫自主神经在房颤的发生或维持中所起的作用并不一定是“促进”，而更倾向于“协调”作用。本实验将进一步研究：心脏脂肪垫内神经丛功能和结构复杂，快速持续高频电刺激心房肌可导致刺激脂肪垫内神经丛内神经活性和功能及Notch信号通路中哪些靶基因发生量变和功能改变。