循环miR-21对新辅助化疗非小细胞肺癌患者的检测价值

董大鹏，安 然，刘 威

(吉林大学第一医院二部，吉林 长春130031)

非小细胞肺癌(NSCLC)作为较常见的肺癌，起病隐匿，通常发现较晚[1]。而手术根治是其主要的治疗手段，但存在复发率高预后不佳等问题[2]。近年来，研究发现新辅助化疗可在一定程度上降低术后的复发率[3]，但缺乏明确指标提示何类患者受益更大。miR-21被证实在多种肿瘤中表达异常且与化疗耐药相关[4]。因此本研究拟探究血清miR-21对NSCLC新辅助化疗预后的检测价值。

1 材料和方法

1.1 临床资料

收集吉大一院二部2015年12月至2016年12月的住院患者血清标本115例，分别为非小细胞肺癌组85例，健康对照组30例，基本资料见表1。每例NSCLC患者至少经过CT和组织病理学确诊为NSCLC。NSCLC患者临床分期为Ⅰ(14例，16.5%)、Ⅱ(50例，58.8%)、Ⅲ(21例，24.7%)，诊断依据为《原发性肺癌诊疗规范(2011年版)》。采血前未进行针对肿瘤的任何治疗措施。健康对照组血清来自本医院体检中心。留血后离心，血清于-80℃冰箱超低温保存。

表1 NSCLC组与正常对照组一般资料比较

1.2 治疗方案

85例NSCLC患者进行手术切除治疗，治疗前加用GP方案新辅助化疗。第1-3天给予静脉滴注顺铂(30 mg/m2/生理盐水500 ml)；第1至第8天给予静脉滴注吉西他滨(1000 mg/m2/生理盐水250 ml)，滴注时间为30 min。化疗前静脉滴注地塞米松(5 mg/250 ml生理盐水)止吐。连续2周期42天辅助化疗。术后行4个疗程GP方案化疗。

1.3 实验试剂

美国Thermofisher公司 mirVanaTMPARIS Kit试剂盒、苏州金唯智生物科技有限公司miR-21和miR-232引物、北京全式金生物技术有限公司TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix试剂盒。

1.4 血清RNA逆转录和miRNA荧光定量

术前血清microRNA提取按照mirVanaTMPARIS Kit试剂盒说明书步骤进行，提取的microRNA采用加尾法进行逆转录，进而进行荧光定量，具体步骤按照TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix。血清中miRNA-232的Ct值NSCLC组和对照组无统计学差异(见图1)，故血清miRNA内参选用miR-232。血清miRNA荧光定量数据处理采用2-ΔΔCt法相对定量法，公式如下:ΔΔCtNSCLC=(CtmiR-21-CtmiR-232)NSCLC-mean(CtmiR-21-CtmiR-232)Control；ΔΔCtControl=(CtmiR-21-CtmiR-232)Control-mean(CtmiR-21-CtmiR-232)Control。

图1 血清miR-232在NSCLC中表达水平

1.5 统计学分析

研究使用卡方检验(χ2)和Student T-检验来评估NSCLC患者和正常对照之间临床变量的频率(IBM SPSS Statistics，Version 21.0.Armonk，NY：IBM Corp)，P<0.05差异显著。

2 结果

2.1 NSCLC组和对照组血清miR-21表达量比较

通过荧光定量法测定85例NSCLC患者和30例正常对照组血清中miR-21含量，结果显示NSCLC患者血清中miR-21的相对表达量为12.54±14.54显著高于其在正常对照组血清中的相对表达量1.81±1.75(P<0.01)，见图2和表2。

注：**P<0.001 与对照组相比

表2 血清miR-21在NSCLC组和对照组中的相对表达量

miR-21(2-ΔΔCt)Control1.81±1.75NSCLC12.54±14.54∗∗P value0.00

2.2 血清miR-21诊断NSCLC的价值

为了解血清miR-21在NSCLC患者中的诊断价值，采用ROC曲线进行评价。结果见图3和表3，miR-21对诊断NSCLC的ROC的AUC为0.854(0.785-0.922)，最佳截取值为5.766，此时血清miR-21诊断NSCLC的敏感度为60.0%，特异度100.0%。

2.3 血清miR-21与新辅助化疗NSCLC患者复发的关系

为了解血清miR-21与新辅助化疗NSCLC患者复发之间的关系，将1年内复发患者、未复发患者和正常对照组血清miR-21含量进行比较。结果见图4和表4，结果显示复发NSCLC患者血清中miR-21的相对表达量为27.28±16.36显著高于未复发NSCLC组和正常对照组血清中的miR-21相对表达量5.03±3.87和1.81±1.75(P<0.01)。

图3 血清miR-21诊断NSCLC的ROC曲线

表3血清miR-21诊断NSCLC的ROC曲线线下面积和置信区间

AUC95%CImiR-210.8540.785-0.922

图4 血清miR-21在复发患者血清中的表达量

ControlNSCLCNSCLC(Recrudesce)miR-21(2-ΔΔCt)1.81±1.755.03±3.8727.28±16.36

3 讨论

miR21由单个基因编码，其位于17p23.2的脆弱位点FRA17B上，并与编码跨膜蛋白49的基因(TMEM49，也称为VMP1)重叠[5]。miR21在肺癌，乳腺癌，胶质母细胞瘤，胃癌，胰腺癌，胰腺神经内分泌肿瘤，肝癌，胆管癌，结肠癌和前列腺癌中过表达[6-8]。miR21通过调节靶基因参与肿瘤细胞侵袭，血管浸润和转移等[9,10]。此外，miR21在结直肠癌患者中的高表达与临床分期，淋巴结转移和远处转移相关，乳腺癌和肝转移阶段伴随着miR21表达水平的增加[11]。一些研究也证实miR-21与化疗耐药相关，抑制胆管癌细胞中miR-21的表达可以增加细胞对吉西他滨的敏感性，高miR-21表达与基于5-FU的化疗反应差， 预后不良有关[4,12]。

因此，我们通过检测非小细胞肺癌患者行新辅助化疗前血清中miR-21的表达量，分析循环miR-21含量与NSCLC新辅助化疗预后的关系。首先，通过对比85例NSCLC患者和30例正常对照组血清中miR-21含量，证实NSCLC患者血清中miR-21的相对表达量为12.54±14.54显著高于其在正常对照组血清中的相对表达量1.81±1.75。另外，miR-21对诊断NSCLC的ROC的AUC为0.854(0.785-0.922)，最佳截取值为5.766，此时血清miR-21诊断NSCLC的敏感度为60.0%，特异度100.0%。这些结果说明miR-21可作为NSCLC的诊断标志物。进一步，我们将1年内复发患者、未复发患者和正常对照组血清miR-21含量进行了比较，发现复发NSCLC患者血清中miR-21的相对表达量为27.28±16.36显著高于未复发NSCLC组和正常对照组血清中的miR-21相对表达量5.03±3.87和1.81±1.75。这一结果说明循环miR-21含量越高患者预后越差。

综上所述，循环miR-21可作为NSCLC的诊断标志物，GP方案对于循环miR-21含量较低的NSCLC患者具有较高的应用价值。