CO2分压对贴壁细胞MRC-5连续传代培养的影响

张伊丽 刘照平 陆敏依 蔡明勇 吴根鹏

（上海荣盛生物药业有限公司，上海 201108）

生物制品的质量控制不仅是对终产品的质量控制，而且是对整个生产过程的连续监控，包括原材料、中间品和制检过程的质控。细胞基质作为病毒性疫苗生产过程中必不可少的原材料，其状态优劣直接影响疫苗产品的质量和产量。MRC-5细胞是人胚肺成纤维细胞，可进行体外传代培养，对多类病毒敏感［1］。自建株以来用于多种病毒性疫苗的生产和检定，得到了良好的安全性验证，如水痘疫苗［2］、带状疱疹疫苗［3］、甲肝疫苗［4］及狂犬疫苗［5］。但MRC-5作为二倍体细胞，具有一定的传代寿命，超过一定代次细胞衰老，与传代细胞相比难以大规模生产。因此提高细胞状态和使用代次对该细胞的产业化应用具有重要意义。

细胞生长的微环境对细胞的影响极大。对于已建株的细胞系，很多工作都是围绕优化培养而开展［6-9］。pH是细胞培养过程中一个重要参数，并且不同细胞株有不同的pH适应范围［10-13］。根据细胞培养方式不同，悬浮培养（包括悬浮细胞和贴壁细胞的微载体培养）使用反应器控制pH更为精确和容易，在一定范围内的pH波动对细胞生长和产物表达不会产生太大影响［14-16］。而贴壁细胞有较多的方瓶、转瓶和细胞工厂静置培养方式，此类容器pH可控性差，在pH条件的优化研究中更多体现在培养起始阶段［6，17-19］，对培养过程中pH动态变化及对细胞产生的影响研究较少。

目前较市售应用的细胞培养基多添加NaHCO3作为缓冲盐，匹配合适的CO2浓度组成pH缓冲对体系。空气中CO2分压会影响培养液pH的稳定性。特别是在开放式培养皿培养细胞或进行高浓度的转化细胞系培养时，需要使用CO2培养箱以保证足够的CO2分压。本实验以NaHCO3调节细胞培养基pH值，并在pH 7.2-7.6范围配合CO2使用情况，对MRC-5细胞连续传代过程中的细胞状态、工作代次和病毒敏感性进行检测分析，旨在提高MRC-5细胞连续传代水平。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 MRC-5细胞（ATCC）由本公司疫苗生产部提供建库，代次为27代，浓度为5.0×106个/mL。水痘-带状疱疹病毒（VZV）毒种，由本公司疫苗生产部提供，代次为32代，滴度约为5.0 Lg PFU/mL。

1.1.2 主要试剂 MEM干粉、胎牛血清、青-链霉素双抗、0.25%胰酶均购自Gibco公司；NaHCO3购自国药集团化学试剂有限公司；台盼蓝溶液购自碧云天生物；EDTA细胞消化液、病毒稳定剂由本公司疫苗生产部提供。

1.2 方法

1.2.1 配制细胞培养液 MEM干粉按照使用说明书溶解后过滤除菌，作为基础培养基备用。按照质量体积比配制5% NaHCO3母液，过滤除菌备用。配制细胞培养液时，使用5%NaHCO3母液调节基础培养基pH，添加胎牛血清10%-15%，抗生素1%。

1.2.2 细胞复苏 从液氮中取出1支冻存的MRC-5细胞，确认批号、代次、浓度，迅速在38±1℃水浴中融化，复苏至T225一次性细胞培养瓶中，轻微摇匀，置37℃，5% CO2浓度的细胞培养箱中连续培养3-4 d至细胞生长成片。

1.2.3 细胞传代培养 复苏细胞生长成片后进行传代。吸去原细胞培养液，添加0.25%胰酶5-10 mL消化1-2 min。加入新鲜细胞培养液重悬，按照1∶4传代比率分装细胞悬液至若干T25细胞培养瓶，置于37℃，5% CO2浓度的细胞培养箱中培养。

约4-5 h细胞贴壁后，更换不同NaHCO3浓度的细胞培养基，并对瓶盖进行封闭式（对照组，CO2气体不能进入细胞瓶）和开放式（试验组，CO2气体可以进入细胞瓶）处理。在继续培养过程中，每隔一定的时间进行培养基pH测定并统计细胞生长密度。每组保留1-2瓶，固定使用同一NaHCO3浓度的培养液和通气处理方式连续传代，并在细胞收获数较低（＜0.2×105个/cm2）达不到传代要求时停止实验。

1.2.4 细胞监测 每天用倒置显微镜观察细胞的生长状态，包括细胞的形态、密度、增殖速度等，并拍照记录。在每一次传代的同时统计收获细胞数和细胞活率。

1.2.5 病毒接种及收获 取VZV毒种按照MOI=0.001-0.01接种生长成片的31代细胞，换液后连续培养2-3 d，待病变率达到35%-90%，使用EDTA消化病变细胞，1 800 r/min离心10 min，使用稳定剂重悬，-70℃冻存备用，进行滴度测定。

1.2.6 病毒滴定 以蚀斑法测定病毒滴度。取冻存的病变细胞，在冷冻和37±1℃条件下反复冻融3-4次，镜检观察细胞完整率≤20%。1 800 r/min×10 min离心取上清，对上清液进行500倍和1 000倍稀释。取预先铺满MRC-5细胞的6孔板，每孔接种病毒上清稀释液100 μL，吸附90 min后添加细胞维持液继续培养7 d，统计每孔蚀斑数。

n：每孔蚀斑数（平均值）；D：稀释倍数；V：每孔接种体积。

2 结果

添加不同比例NaHCO3母液（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%和4.0%）调节MEM基础培养基pH，配制后的完全培养液起始pH值为7.3-7.7。在2.0%和3.0%添加比例时pH分别为7.3和7.5，选择此两种浓度设计实验，观察CO2的使用对细胞培养液pH稳定性以及对细胞培养效果的影响。

2.1 培养条件对细胞培养液pH稳定性的影响

以2.0%封闭培养作为对照组，3%试验组同时设计封闭培养和开放培养，监测31代次细胞培养过程中的pH变化情况并统计。图1显示封闭培养的2%和3%两组细胞在培养2 h后pH即发生急速升高，在8-30 h内达到最高，2.0%组约7.7，3.0%组约8.0，此时培养液呈深红偏紫色。随后，pH开始下降，在96 h后2.0%组下降至7.2-6.8，3.0%组下降至7.3-7.1。此时培养基呈红偏黄色。而开放培养的3%组细胞培养液则相对稳定，在连续144 h的培养过程中最高为7.5，最低为7.2，培养液颜色呈红偏棕黄色。

图1 细胞培养过程中pH动态变化趋势

2.2 培养条件对细胞传代培养的影响

镜检观察31代细胞状态，统计并绘制细胞生长增殖曲线。3组细胞在早期贴附、爬壁阶段（24-48 h）生长增殖相近，均可正常贴壁增殖，形态清晰呈典型纤维状。但在72 h汇合率开始体现出差异，3%开放组细胞排列成形，至96 h已有80%以上的汇合率。而封闭培养的细胞则增殖缓慢，细胞折光性强，3%组在培养120 h后仍未能成片（图2）。通过31代细胞生长增殖曲线也可以看出，开放培养的细胞从延滞期进入对数期明显快于封闭组（图3）。

图2 31代细胞生长形态

图3 31代细胞生长增殖曲线

传代早期细胞状态和细胞数尚无明显差异，细胞形态清晰呈典型纤维状，成片后细胞排列整齐，汇合率90%以上，收获细胞数在（0.5-0.7）×105个/cm2。连续传代至31代后3组细胞收获密度均开始下滑，细胞形态和细胞活率开始体现出差异。封闭培养细胞折光性增强，胞内颗粒性内涵物逐渐增多，细胞排列散乱，生长增殖速度和细胞活率急剧下降，至35-37代已不能成片，收获细胞数低于阈值，达不到继续传代要求，见图4。开放培养细胞形态仍保持纤维状排列，细胞活率维持在80%以上，细胞状态下降趋势相对缓慢，可连续传代至41代。

2.3 培养条件对细胞产毒影响

取31代细胞接种VZV病毒，观察病毒敏感性并统计产毒滴度。封闭培养细胞接毒后24 h细胞有圆缩、肿大、折光性增强，48 h局部融合病变，病变率约为60%-80%（图5）。收获病变细胞后采用反复冻融法释放病毒，噬斑法检测病毒滴度分别为4.67 Lg PFU/mL和4.60 Lg PFU/mL。开放组细胞病变与封闭组相似，产毒滴度略高约为4.83 Lg PFU/mL，但差异不显著（图6，P=0.13＞0.05）。

图4 连续传代细胞收获密度和细胞活率

图5 MRC-5细胞接种VZV病变形态

图6 MRC-5细胞接种VZV产毒滴度

3 讨论

细胞培养基除提供细胞生长所必须的营养成分外，还负责维持适宜的理化环境，如pH稳定。培养基一般通过添加碳酸氢盐或其他有机缓冲盐（如HEPES），稳定培养过程中pH变化在一个合理范围。在采用碳酸氢钠作为缓冲时，培养液pH值取决于碳酸氢根（HCO3-）和溶解态CO2浓度之间的精密平衡。若无CO2外环境或CO2分压不足，HCO3-水解反应平衡式右移，导致pH快速升高。而在培养过程中随着细胞生长、增殖，细胞代谢副产物，如乳酸逐渐累积增多，pH才会缓慢下降。这种pH值的较大起伏变化是细胞生长的不利因素。

本实验对细胞培养过程中的pH变化进行了动态监测。从pH变化曲线和对应的细胞生长曲线可以看出，不恰当的培养方式使得碳酸氢根被过度水解消耗，导致细胞培养液pH培养2 h就会急剧升高，并维持至30 h左右。此时细胞生长正处于延滞期，细胞行为处于贴附、爬壁过程中，过高的pH环境会造成细胞贴壁率低，细胞受损等。而在2-3 d（约48 h）后，随着细胞增殖进入对数期，细胞代谢加快，密度升高，细胞产酸增多，pH开始回落。但碳酸氢根浓度过低，已无法起到缓冲效果，导致培养基pH持续走低。pH大幅波动不仅对单代次细胞生长造成损伤，而且这种损伤还可能累积影响整个细胞培养周期。高代次的封闭组细胞折光性增强，细胞内含物、颗粒性物质增多，细胞活率下降明显。而开放组细胞仍能保持胞质均匀清晰，细胞骨架排列整齐，并维持较高的细胞活率，可连续传代至41代。两组细胞接种VZV测试产毒效果，开放组细胞产毒滴度略高于封闭组。综上验证了稳定的pH环境对细胞代次和状态具有重要的影响，并且这种影响会在连续的传代培养中得到累积体现。

疫苗生产用细胞基质通常包括原代细胞、二倍体细胞和连续传代细胞。MRC-5属于人类同源性二倍体细胞系，与原代细胞相比，可建立种子库系统进行充分鉴定和标准化，利于质量控制；与连续传代细胞相比，理论上不存在致肿瘤的潜在风险［20］。但MRC-5由于传代寿命的限制，难以大规模生产。为突破工作代次，提升细胞状态，可添加辅助成分进行优化研究［21-22］，但由此可能带来引入外源因子的风险以及产品安全性风险。因此为提高细胞状态选择合适的培养优化方式具有重要意义。本实验仅通过调节NaHCO3浓度配合CO2分压的使用，显著提高了MRC-5细胞状态和连续传代能力，在使用方瓶、或放量应用细胞工厂、转瓶培养MRC-5细胞时，为其优化应用提供了数据支持。

4 结论

通过监测贴壁细胞MRC-5静置培养过程中的pH动态变化，发现不恰当的培养方式会导致细胞在延滞期和对数期早期受到损伤，并且这种损伤会在连续的传代培养中积累。而通过调节NaHCO3浓度与CO2分压的使用，可以明显提高MRC-5细胞状态和连续传代能力。