乳腺癌组织微小RNA－191、性别决定区高迁移率组盒4 mRNA的表达观察

何悦，夏明智，胡小波

(湖南省肿瘤医院，长沙410013)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。我国2015年新发乳腺癌27.2万例，死亡7万例［1]。近年来随X线、超声及MRI等影像学技术的发展和手术、化疗、内分泌治疗及靶向药物治疗的发展，乳腺癌患者的生存率明显提高［2]。但晚期乳腺癌患者病死率仍较高，中位总体生存期仅2～3年［3]。深入研究乳腺癌发生发展的分子生物学机制仍是目前研究热点。微小RNA(micro RNA，miR)是一类内源性非编码RNA调控分子，长度18～25个核苷酸，参与正常细胞的增殖、分化、凋亡等过程的调控，同时参与肿瘤、炎症、免疫等病理生理学过程［4]。研究［5]表明，乳腺癌组织miR－191表达增加可结合并抑制下游靶基因DICER1的表达，影响下游细胞信号传导，促进肿瘤细胞的增殖和转移等。性别决定区高迁移率组盒4(Sex－determining region related high－mobility group box 4，SOX4)，属 SOX 家族成员，是性别决定基因Sry的相关基因，是能与DNA结合的HMG结构域，在细胞分化、生长过程中的转录、调控中起重要作用。研究［6]报道，SOX4在多种肿瘤中发挥重要的作用，参与肿瘤进展、肿瘤血管生成及化疗耐药性等。有学者［7]应用生物信息学方法对肿瘤组织中miR－191的靶基因进行预测，结果SOX4是其作用的重要靶基因之一，通过促进肿瘤细胞增殖、抑制凋亡等机制促进肿瘤的发生发展。我们对比观察了乳腺癌组织及癌旁组织miR－191、SOX4 mRNA的表达变化，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2016年2月～2018年2月于我院诊治的104例女性乳腺癌患者。纳入标准：①均经组织病理学检查明确诊断为乳腺癌;②所有患者均为初次诊治，既往未接受过放化疗等抗肿瘤治疗;③临床病理资料完整，患者及家属均知情同意并已签署知情同意书。排除标准：①患者合并有急性感染性疾病，如泌尿系感染、呼吸道感染等;②合并其它恶性肿瘤病史;③合并严重的心肝肺肾等器官功能不全。104例患者年龄32～78(54.3±6.7)岁;浸润性导管癌59例，浸润性小叶癌24例，导管原位癌13例，黏液癌8例;肿瘤直径≤2 cm者33例，＞2 cm者71例;伴淋巴结转移者39例，无淋巴结转移者65例;根据第8版国际抗癌联盟TNM肿瘤分期标准［8]：Ⅰ期21例，Ⅱ期45例，Ⅲ期24例，Ⅳ期14例;组织学分级：Ⅰ级14例，Ⅱ级68例，Ⅲ级22例;孕激素受体(PR)阳性43例，阴性61例;雌激素受体(ER)阳性62例，阴性42例;c－erbB2的阳性标准根据4级系统进行评估(0、1+、2+、3+)，评分 0、1+、2+判定为阴性，阴性 28 例，评分3+判定为阳性，阳性76例;三阴乳腺癌27例，非三阴乳腺癌77例。104例患者均行肿瘤切除术，术中保留部分乳腺癌组织及癌旁组织，癌旁组织距离癌组织边缘5 cm以上。置于冻存管内液氮速冻后，转运至实验室后置于－80℃冰箱保存。

1.2 乳腺癌组织及癌旁组织miR－191、SOX4 mRNA检测 采用荧光实时定量PCR(qRT－PCR)法。取约100 mg组织标本，应用TRIzol法提取总RNA，TRIzol试剂购自美国罗氏公司。紫外分光光度计测定RNA溶液的吸光度值用于计算其浓度及纯度，将合格的总RNA置于－80℃冰箱保存。以总RNA为模板，用TaqMan RNA反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA，试剂盒购自美国ABI公司。总反转录体系为 20 μL，包括 0.2 μL 浓度为 200 U/μL 的M －MLV逆转录酶、1.2 μL 反转录引物、0.75 μL 浓度为10 moml/L 的 dNTPs、2 μg总 RNA，无 RNA 酶水及4 μL反转录缓冲液。反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。实验步骤严格按照反转录试剂盒说明书进行。获得的cDNA产物4℃保存。miR－191反转录引物序列5'－GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAG－CTG－3'，特异性茎环引物正向引物序列：5'－ATAGGATCCAGGTGAGCGTCTTGTTCCCTC － 3'，反向引物序列：5'－ATAGAATTCGGTTCCAGAGATGGCCACCAGC－3'，内参基因U6反转录引物序列5'－CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT －3'，上游序列：5'－CTCGCTTCGGCAGCACA －3'，下 游 序 列：3'－ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC－5';SOX4上游引物序列：5'－ CCTTAACCTGCCACCAGTGTC －3'，下游引物序列：5'－TCCAGTGGTTTAAACGGCACG－3'，以 GAPDH作为内参照，上游引物序列：5'－CAAGGTCATCCATGACAACTTTG －3'，下游引物序列：5'－ GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG －3'。总反应体系 20 μL，包括 2 μL cDNA，0.1 μL TaqDNA 聚合酶、1 μL 上下游引物、1 μL 20ⅹSYBR GreenⅠ及0.4 μL 浓度为 10 mmol/L dNTPs。荧光定量 PCR反应条件为：95℃ 2 min，94℃ 变性15 s，60℃ 退火20 s，72℃延伸10 s，40个循环。所有反应均在ABI7900实时定量PCR仪上完成，采用相对Ct值方法，miR－191、SOX4表达与内参基因U6的比值为目的基因相对表达量，以2－ΔΔCt代表，每个样本重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间均数比较采用两独立样本t检验。Person线性相关分析乳腺癌组织SOX4 mRNA和miR－191表达的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织miR－191、SOX4 mRNA相对表达量比较及其相关性 乳腺癌组织与癌旁组织miR－191相对表达量分别为8.27±0.28、1.07 ±0.09，SOX4 mRNA 相对表达量分别为 8.96±1.20、1.24 ±0.27。二者比较，P 均 ＜0.05。乳腺癌组织中miR－191表达与SOX4 mRNA表达呈正相关(r=0.627，P＜0.05)。

2.2 miR－191、SOX4 mRNA表达与乳腺癌患者临床病理参数的关系 癌组织中miR－191及SOX4 mRNA表达与ER是否阳性、肿瘤分期及组织学分级有关(P均 ＜0.05)，而与年龄、是否绝经、肿瘤直径、PR是否阳性、c－erbB2是否阳性、是否是三阴性乳腺癌及是否存在淋巴结转移无关(P均＞0.05)。见表1。

表1 miR-191、SOX4 mRNA相对表达量与乳腺癌患者临床病理参数的关系

3 讨论

目前认为乳腺癌是由遗传、环境及个体差异等因素共同作用下导致。具有乳腺癌家族史的患者发病率较高，目前鉴定出的主要相关癌基因如BRAC1及抑癌基因p53等。患者月经状况、良性疾病病史及生殖生育方式等因素，也是影响乳腺癌发生发展的重要环境因素。肿瘤直径、转移淋巴结数目、临床分期及组织学分级也是影响患者预后的重要临床病理因素。目前乳腺癌的治疗包括手术、内分泌治疗、放化疗级靶向药物治疗等［9]。肿瘤早期浸润和出现远处转移是治疗失败的重要原因。虽然新的治疗方案能提高患者治疗的有效率和完全缓解率，但患者仍不能获得满意的长期生存［10]。因此，有必要深入研究乳腺癌的发生发展的分子机制。

近年来研究［11]发现乳腺癌细胞中存在多种miRNAs表达异常，可参与乳腺癌的发生、发展及转移等恶性生物学过程。miR－191是miR－191/425家族的成员，在前列腺癌［12]、肺癌［13]等多种肿瘤中表达降低，可通过结合DAB2基因3'UTR抑制其表达，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移等过程，是一种有希望的肿瘤生物标志物和治疗靶标。miR－191在前列腺癌［12]、肺癌［13]等肿瘤中均存在表达上调的现象，并且通过影响TIMP3、NFIA等靶基因的表达，参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡、浸润及转移等过程。本研究中，乳腺癌组织中miR－191的相对表达量为显著高于癌旁组织，与人乳腺癌细胞检测结果［14]一致。目前其表达升高的机制尚不清楚，可能与长链非编码RNA如ANRIL促进miRNA启动子的表达或直接作为miRNA前体［15]，进而活化下游NF－κB及Wnt/β－catenin信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和转移［16]。本研究结果表明，乳腺癌组织中miR191的表达与ER是否阳性、肿瘤分期及组织学分级有关，说明癌组织中miR－191表达与肿瘤的发生发展密切有关。研究［19]表明，p53对miR－191具有直接调控的作用，p53可下调乳腺癌细胞中miR－191的表达，进而抑制miR－191的凋亡抑制作用，高度保守的p53基因的突变或缺失多发生于高级别、进展期恶性肿瘤中，P53基因突变后肿瘤细胞中miR－191的表达进一步升高。有研究［14]报道，ER阳性的乳腺癌细胞株中miR－191的表达是正常乳腺癌细胞的8倍，是ER阴性癌细胞3倍。miR－191具有促进乳腺癌细胞的增殖、侵袭能力，当沉默miR－191表达后，肿瘤细胞发生G0/G1期阻滞、迁移和侵袭能力减弱［14]。

SOX4是C组SOX基因之一，是由单个外显子基因编码，分子量为47 kDa，可通过HMB结构域选择性结合靶基因A/TA/TCAAAG序列并调节靶基因的转录。除SOX4参与正常细胞的分化发育的调节外，近年来亦有研究报道SOX4在多种癌症中均发挥重要作用，参与肿瘤发生发展的过程，可通过激活肿瘤细胞上皮间质转换的细胞信号转导通路，降低E－钙黏素表达，升高波形蛋白表达，促进肿瘤细胞的浸润和转移［18]。本研究中，癌组织中SOX4 mRNA相对表达量显著高于癌旁组织，与以往研究［19]结果一致。其机制可能是肿瘤中miRNA结合于SOX4 mRNA的3'非编码区，降低mRNA的稳定性，SOX4表达减少，进而抑制肿瘤的浸润、转移及凋亡［20]。乳腺癌组织中SOX4 mRNA表达与ER是否阳性、肿瘤分期及组织学分级有关，结果表明SOX4 mRNA表达随着分期和组织学分级的升高而表达增加，SOX4的高表达提示患者不良预后。其机制可能是SOX4促进N－钙黏素、E－钙黏素及vimentin等表达，使肿瘤细胞发生上皮间质转换，促进肿瘤细胞的浸润和转移，参与乳腺癌的进展［21]。此外，高级别肿瘤中，抑制SOX4基因表达的非编码RNA，如miR－338－3p水平显著下降，亦促进肿瘤的恶性进展［22]。

本研究中，乳腺癌组织中miR－191相对表达量与SOX4 mRNA的相对表达量呈明显正相关，其原因可能是SOX4是miR－191的靶基因，miR－191结合于SOX4mRNA，增加mRNA稳定性，促进SOX4表达，SOX4进一步结合p53，抑制p53介导的凋亡，促进肿瘤生长［23]。

综上所述，乳腺癌组织中miR191、SOX4 mRNA高表达，两者共同参与乳腺癌的发生、发展过程。miR191、SOX4 mRNA有望成为新乳腺癌诊断、治疗及预后评估的肿瘤标志物，但本研究尚存在纳入样本量少等缺点，有待于进一步大样本深入研究两者相互作用机制。