高效液相色谱法测定辣椒酱中苯甲酸和山梨酸的含量

贵州省食品检验检测所（550004）高源 田莉 季伟 肖丹

贵州医科大学（550025）刘尚莹

食品防腐剂能抑制食品中微生物的繁殖，防止腐败变质，延长保存期[1]。在食品加工过程中，人们采用了许多不同的手段来杀死或者抑制微生物，添加防腐剂是其中最方便而有效的一种方法，因而被广泛使用于食品加工行业中[2]。然而许多商家和企业为了减小成本和谋取利益，出现了防腐剂的超标使用、违规使用、使用劣质防腐剂、不在食品标签中标注添加了防腐剂、超范围使用防腐剂等几种情况[3]。化学合成防腐剂使用不当会有一定的副效应， 长期过量摄入会对身体健康造成危害[4]。主要表现在：影响人体新陈代谢平衡；对神经系统的损害(如老年痴呆症、帕金森综合征及周围神经炎等疾病)；影响胎儿生长发育；引起叠加中毒现象，可能构成致癌危险等。因此，检测人员做好相关质量检查工作是关键点。科研检验部门应深入研究，找出快速简便、灵敏经济的检测方法和适用仪器。实施检测措施，完善检测队伍，加强对防腐剂含量的快速检测，从而及时发现并处理相关违法情况。

1 材料

1.1 主要仪器 eppendorf Centrifuge 5810R高速冷冻离心机；隔膜真空泵；戴安UltiMate3000高效液相色谱仪，Chromeleon色谱工作站； Thermo AcclaimTM色谱柱（C18，250×4.6㎜，5μm，柱号为006644）；梅特勒分析天平；超声水浴锅；明澈D24UA纯水超纯水一体机。

1.2 标准品及试剂 标准品：纯度为99.5%苯甲酸标准品（Dr.Ehrenstorfer GmbH）；纯度为99.0%山梨酸标准品（Dr.Ehrenstorfer GmbH）。试剂：乙酸铵（优级纯），成都艾科试剂；甲醇（色谱纯），默克公司；乙酸锌（优级纯）；超纯水；0.45μm微孔滤膜；亚铁氰化钾（优级纯）；液相进样小瓶。样品：贵州省食品药品检验所监督抽查的辣椒酱样品。模拟阳性样品（在辣椒酱样品中加入食品级的苯甲酸和山梨酸，均匀制样，测定其含量）。

2 方法

2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo AcclaimTM色谱柱(C18 ，250×4.6㎜，5μm）；流速：1mL/min；色谱柱温：35℃；检测波长：230nm；流动相：甲醇（0.02mol/L），乙酸铵（2：98）；进样量：10μL。见附图1、2。

2.2 样品前处理方法 随机均匀取5.00g模拟样品，精密称定，共有六份，分置50mL离心管中，加入30mL超纯水，充分摇匀后，再加入1mL亚铁氰化钾溶液，1mL乙酸锌溶液，混匀，在离心管中定容至50mL刻度线，超声处理15min后，以5000r/min的转速离心5min。取上清液用0.45微孔滤膜过滤，注入液相进样小瓶，作为待测供试品溶液。

2.3 样品测定 分别准确吸取山梨酸和苯甲酸标准和待测样品溶液10μL注入液相色谱仪，记录色谱峰面积/峰高，根据峰面积/峰高-山梨酸浓度曲线和峰面积/峰高-苯甲酸浓度曲线求得样品中山梨酸和苯甲酸含量。

2.4 标准溶液的制备及线性范围的测定 标准品储备液的制备：精密称取苯甲酸标准品0.01148g置于100mL容量瓶中，用甲醇超声溶解后定容至刻度。精密称取山梨酸标准品0.01216g于100mL容量瓶中，用甲醇超声溶解后定容至刻度。混合对照品溶液制备：取山梨酸标准品储备液5mL于100mL容量瓶中，取苯甲酸标准品储备液10mL于100mL容量瓶中，均用水定容至刻度。所得山梨酸浓度为12.09μg/mL；苯甲酸浓度为10.54μg/mL。

分别吸取上述混合标准品溶液1、2、5、10、15、20mL置于50mL容量瓶中，定容至刻度。进样量为10μL，分别进样测定，记录保留时间及峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得其回归方程。

在4.57～182.8μg/mL范围内苯甲酸质量浓度与峰面积线性关系良好，回归方程为y=0.4007x-0.001，r=1。在2.14～85.76μg/mL范围内山梨酸质量浓度与峰面积线性关系良好，回归方程为y=0.6996x-0.0064，r=1。

2.5 精密度和重复性考察 取混合对照品溶液连续进样6次，进样量为10ul，可得出精密度苯甲酸峰面积相对标准偏差RSD是0.099%，山梨酸峰面积相对标准偏差RSD是0.13%。平行处理6次样品，进样量为10uL，在优化色谱条件测得样品重复性为，苯甲酸含量相对标准偏差RSD是0.69%，山梨酸含量相对标准偏差RSD是2.4%。说明其精密度，重复性良好。

2.6 加标回收率的考察 混合标准品溶液制备：精密称取苯甲酸标准品0.01176g于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。精密称取山梨酸标准品0.01067g于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。分别精密量取20mL苯甲酸标准储备液、10mL山梨酸标准储备液于200mL容量瓶中，稀释至刻度，其浓度分别为23.40μg/mL、10.56μg/mL。

附图1 苯甲酸、山梨酸标准品色谱图

附图2 苯甲酸、山梨酸样品色谱图

供试样溶液制备：称取上述模拟阳性样品5.00g，共6份，精密称定，分别置于50mL离心管中。其中1、2管精密加入混合标准溶液5mL，3、4管精密加入混合标准溶液15mL，5、6管精密加入混合标准溶液25mL，按2.2所述方法制备样品溶液，精密吸取10μL，注入液相色谱仪测定。记录峰面积值，计算苯甲酸，山梨酸回收率。其计算公式为：

回收率平均值苯甲酸为98.11%，RSD为1.5%，山梨酸为96.91%，RSD为1.6%。

2.7 实际检出限的测定 苯甲酸实际检出限的确定：吸取浓度为5.2525μg/mL苯甲酸标准品溶液0.4mL，置于装有5.0g样品的50mL容量瓶中，依照2.2所述方法进行样品处理。精密吸取10μL注入液相色谱中，记录苯甲酸峰高，与噪音相比，满足3倍信噪比的要求，可得到苯甲酸的实际检出限为0.4mg/Kg。

山梨酸实际检出限的确定：吸取浓度为5.0705μg/mL山梨酸标准品溶液0.3mL，置于装有5.0g样品的50mL容量瓶中，依照2.2所述方法进行样品处理。精密吸取10μL注入液相色谱中，记录山梨酸峰高，与噪音相比，满足3倍信噪比的要求，可得到山梨酸的实际检出限为0.3mg/Kg。