固相萃取LC-MS/MS法测定疏血通注射液中次黄嘌呤浓度*

王献瑞 ，赵西子 ，王晓明 ，郭亚卿 ，潘桂湘 ，黄宇虹

（1.天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室（培育），天津 301617；2.天津中医药大学第二附属医院，天津 300250）

疏血通注射液是由水蛭[1-2]、地龙[3-4]两味动物类中药经低温提取和膜分离等工艺制成的中药复方制剂[5]，具有活血化瘀、通经活络的功效，临床常用于瘀血阻络所致的缺血性中风病中经络急性期，症见半身不遂、口舌歪斜、语言謇涩[6-7]。疏血通注射液化学成分复杂，含有多肽、多糖、氨基酸、次黄嘌呤等物质[8-10]，目前其真正发挥药效作用的物质基础尚不明确。据文献报道[11-12]，次黄嘌呤具有明确的生物活性，能透过细胞膜进入细胞内，提高多种酶的活性，参与机体一些重要生理机能的调节。因此，本文以次黄嘌呤为指标成分，建立液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）法对其进行定量分析，以期为疏血通注射液质量分析、评价以及质量标准的制定提供参考和依据。

目前，疏血通注射液中次黄嘌呤的测定，采用的大多是高效液相色谱-紫外法（HPLC-UV）[13-14]，检测波长为254 nm。由于疏血通注射液中众多成分在254 nm处具有紫外吸收，需进行长达50 min的梯度洗脱，使次黄嘌呤与注射液中的其他干扰物质实现完全的色谱分离，次黄嘌呤出峰时间为13min，整个分析周期相对较长[15]。LC-MS/MS具有高选择性、高灵敏度、高准确性的特点[21]，尤其是具有独特的质量分辨能力，能在复杂基质中专属、灵敏、准确地检测某个或某几个成分。本研究采用固相萃取LC-MS/MS法测定疏血通注射液中次黄嘌呤浓度，分析时间缩短至3.50 min，次黄嘌呤出峰时间为1.02 min，可较大程度提高分析的效率。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国waters公司），Waters Xevo TQ-S三重串联四极杆质谱仪（美国waters公司）；MiniSpin Plus高速离心机（德国Eppendorf公司），AX205十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），Synergy UV超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试剂和药品 疏血通注射液（牡丹江友博药业股份有限公司）。次黄嘌呤标准品（德国Sigma公司，纯度99%以上），6-巯基嘌呤标准品（德国Aldrich公司，纯度98%以上）。甲醇（色谱纯，德国Sigma公司），甲酸（色谱纯，ROE公司），超纯水为Millipore超纯水系统制得。Sep-pak C18固相小柱（500 mg，waters公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪系统：二元泵系统、自动进样器、柱温箱，Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分析柱，BEH C18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）保护柱；流动相为甲醇（A），0.1%甲酸水（B），流速：0.3 mL/min；柱温40℃，进样量2 μL，分析时间为3.50 min。梯度洗脱程序见表1。

表1 色谱条件梯度洗脱程序表

2.2 质谱条件 Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱，ESI负离子模式，MRM扫描方式。参数设置：毛细管电压3.0 kV，锥孔电压30 V，氮气压力7 psi，脱溶剂气温度400℃，脱溶剂气流速800 L/h，锥孔气流速150 L/h，碰撞气流速0.15 mL/min。化合物MRM方法参数见表2。

表2 次黄嘌呤与内标的MRM方法参数

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取次黄嘌呤适量，加甲醇制成100 μg/mL的次黄嘌呤储备液；另称取内标6-巯基嘌呤适量，少量甲醇溶解后用甲醇-水（含0.2%甲酸）（2∶8） 配制成 125 μg/mL 的 6-巯基嘌呤储备液。用甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）稀释上述储备液，制得含次黄嘌呤系列浓度 500、400、300、200、100 ng/mL的混合对照品溶液（含内标250 ng/mL）。2.3.2 供试品溶液制备 精密移取100 μL疏血通注射液和100 μL浓度为125 μg/mL的6-巯基嘌呤溶液，加于已活化的C18固相萃取小柱上，用300 μL水洗除杂，再用 1.00 mL 甲醇-水（2∶8，含 0.2%甲酸）洗脱，取洗脱液 100 μL 用甲醇-水（2∶8，含 0.2%甲酸）稀释 10倍，摇匀，再取 200 μL用甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）稀释5倍，混匀，即得。

2.3.3 阴性对照液制备 取1 mL疏血通注射液，加黄嘌呤氧化酶37℃水浴温孵2h，精密移取100μL经酶促反应后的疏血通注射液，加于C18固相萃取小柱上，其余按“2.3.2”项下方法操作，制成不含次黄嘌呤的阴性对照液。

2.4 专属性试验 取阴性对照液、对照品溶液和供试品溶液分别进样测定，次黄嘌呤、6-巯基嘌呤色谱峰形良好，测定无干扰，次黄嘌呤保留时间为1.02 min，6-巯基嘌呤保留时间为1.22 min，结果见图1。

图1 疏血通注射液中次黄嘌呤及内标的MRM色谱图

2.5 线性关系考察 吸取“2.3.1”项下系列浓度混合对照品溶液，进样2 μL测定，以次黄嘌呤质量浓度（X）为横坐标，待测物与内标的峰面积比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程Y=4.299×10-3X+9.246×10-3，r=0.999，表明次黄嘌呤在0.1～0.5 μg/mL范围内线性关系良好。

2.6 精密度实验 精密吸取对照品混合溶液2 μL，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，测得次黄嘌呤与内标峰面积比值，相对标准偏差（RSD）为0.54%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性实验 精密移取同一批号的疏血通注射液 100 μL，按“2.3.2”项制备供试品溶液，平行6份，进样测定，RSD为0.86%，表明样品重现性良好。

2.8 稳定性实验 室温下，精密吸取同一供试品溶液 2 μL，分别在 0、2、4、6、8、12、24、48 h 进样，测次黄嘌呤与内标峰面积比值，RSD为0.84%。结果表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.9 加样回收率实验 精密移取同一批号已知含量的疏血通注射液6份，每份50 μL，精密加入浓度为 200 ng/mL 的对照品溶液 28 μL，按“2.3.2”项下处理与测定，计算回收率，结果见表3。

表3 次黄嘌呤加样回收率试验结果（n=6）

2.10 样品浓度测定 分别精密移取各批号疏血通注射液 100 μL，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，内标法计算次黄嘌呤浓度，结果见表4。

3 讨论

3.1 流动相的选择 实验分别考察了乙腈-水和甲醇-水等流动相系统，结果发现当使用乙腈-水或乙腈-水（含0.1%甲酸）为流动相时，次黄嘌呤峰形尖而细，但主峰后出现一个小的裂分峰；当使用甲醇-水为流动相时，次黄嘌呤峰形较宽，且裂分为两个大小相当的双峰，但若将水相改为0.1%甲酸水时，即以甲醇-水（含0.1%甲酸）为流动相，峰形对称尖锐且未出现裂分，响应较高。当以甲醇-水（含0.2%甲酸）为流动相时，其峰形和响应与甲醇-水（含0.1%甲酸）相当，考虑到色谱柱对酸的耐受程度，实验最终选择甲醇-水（含0.1%甲酸）作为流动相。

表4 疏血通注射液中次黄嘌呤浓度测定结果

3.2 稀释溶剂的选择 在供试品和对照品溶液制备过程中，发现终溶液如果所含甲醇比例较高，会因与流动相不匹配而产生强溶剂效应，导致色谱峰形的畸变；反之，如果采用纯水稀释系列溶液，则会因为内标在水中的溶解度低而析出形成浑浊液体。实验考察比较了甲醇-水系统（水相不含，或含有0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.3%甲酸） 不同比例 5∶5、4∶6、3∶7 和2∶8作为稀释剂时，次黄嘌呤和内标6-巯基嘌呤的峰形和响应，结果表明当以甲醇-水（2∶8，含0.2%甲酸）为稀释剂时，二者的响应最高且峰形良好。

3.3 离子源的选择 考察了待测物在ESI和APCI两种电离方式下的响应，发现采用APCI电离源，次黄嘌呤和6-巯基嘌呤的响应极其微弱，而采用ESI电离源二者的响应提高了几个数量级，这可能与次黄嘌呤和6-巯基嘌呤均为极性化合物有关，更适合选用ESI电离源。

3.4 电离方式的选择 将次黄嘌呤和6-巯基嘌呤对照品溶液经由蠕动泵连续进样，比较正、负电离方式下化合物的响应，发现次黄嘌呤和6-巯基嘌呤在负离子模式下，均可产生响应较高且稳定的[MH]-离子。因此选择在负离子模式下采用MRM扫描方式检测。

3.5 实验结果分析 本文建立的分析方法可方便、准确测定疏血通注射液中次黄嘌呤浓度，为其提供技术支持，较常规UV检测方法可大大缩短分析时间。国家食品药品监督管理局颁布的WS3-548（Z-084）-2005（Z）文件，要求疏血通注射液中含次黄嘌呤不得低于0.05 mg/mL，由表4可见，20个批次疏血通注射液中次黄嘌呤浓度稳定集中在0.117～0.138 mg/mL，即（0.129±0.005）mg/mL（n=20），表明产品质量合格、生产工艺稳定，次黄嘌呤可作为疏血通注射液质量分析、评价的指标成分。

4 结论

本文所建立的固相萃取LC-MS/MS方法简便、准确、灵敏，可用于疏血通注射液中次黄嘌呤浓度测定。