健脾活血方含药血清对肝癌细胞肝细胞生长因子/c-Met通路、尿激酶型纤溶酶原激活因子分泌及缺氧状态下细胞活性及增殖的影响▲

方 祯 卜文静 许尤琪

(南京中医药大学第二附属医院暨江苏省第二中医院肿瘤科，南京市 210017，电子邮箱：fssda68@163.com)

全球每年有超过50万人罹患肝癌，其中超过50%发生在中国，患者的五年自然死亡率超过95%[1]。尽管已经有切除手术、经导管肝动脉化学栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)等治疗手段，使得肝癌患者术后5年总生存率达到53%，转移和复发仍然是肝癌患者术后病情恶化的主要原因和长期存活的主要障碍，术后五年复发率仍高达62%[2-4]。肿瘤转移需要突破细胞外基质，而尿激酶型纤溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是重要的蛋白水解酶，能有效地降解细胞外基质[5-6]。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种可调节多种细胞生长、运动和形态发生的多功能因子，其受体c-Met过表达于多种肿瘤细胞，具有酪氨酸激酶活性，二者形成HGF/c-Met信号通路，刺激多种肿瘤细胞的增殖与运动[7-9]。越来越多的研究表明中药健脾活血方能够改善癌症预后，减少复发与转移[10-12]，其是否通过HGF/c-Met通路影响uPA的合成从而抑制癌症的复发和转移值得进一步探索。本研究探讨健脾活血方含药血清对缺氧状态下肝癌细胞活性及增殖的影响，以及其抑制癌症复发和转移的可能分子机制，旨在为中医改善肝癌预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)细胞活性检测试剂盒(上海碧云天公司，产品编号：C0009)，Transwell小室(美国Corning公司，孔径：8.0 μm)，Cell-Light EdU Apollo567试剂盒(锐博生物，货号：C10310-1)，12孔细胞培养版(美国Corning公司，型号：Costar 3513)，人uPA酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，货号：EK0535)，人HGF酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，货号：EK0369)，兔源c-Met一抗(武汉博士德生物工程有限公司，货号：BM4116)，β-肌动蛋白一抗(武汉博士德生物工程有限公司，货号：BM0627)，增强型RIPA裂解液(武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR0102-100)，羊抗兔过氧化物酶标记的二抗(武汉博士德生物工程有限公司，货号：BA1056)，超敏电化学发光即用型底物(武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR1171)，免疫印迹试验专用一抗二抗稀释液(武汉博士德生物工程有限公司，货号：AR1017)，HGF与c-Met实时荧光定量PCR反转录引物由上海生工生物合成，TRIzol试剂(美国Thermo Fisher公司，货号：15596026)，焦碳酸二乙酯水(上海碧云天公司，货号：R0021)，SYBR Green qPCR Mix(上海碧云天公司，货号：D7260)，氯化钴(Sigma公司，货号：C8661-25G)。R500通用型小动物麻醉机(深圳瑞沃德公司)等。

1.2 细胞培养 人肝癌细胞系SMMC-7721购自北纳生物细胞库(货号：BNCC338089)。细胞于含10%胎牛血清(美国Gibco公司，批号：16000044)的RPMI-1640(美国Gibco公司，批号：C11875500BT)培养基中，放置于5% CO2、37℃培养箱中培养，使用含0.25%乙二胺四乙酸的胰酶消化后传代，取对数生长期融合度约80%左右的细胞用于后续实验。

1.3 实验动物 SD大鼠20只(雌雄各半)购自南京中医药大学动物实验中心[动物生产许可证号：SYXK(苏)2005-0009]，6月龄，平均体重为300 g。饲养条件：相对湿度45%～65%，温度21℃～26℃，光暗循环各12 h，且所有大鼠可自由获取水和食物。采用随机数字表法将大鼠分为实验组及对照组。

1.4 健脾活血方含药血清的制备 健脾活血方由以下中药组成：太子参30 g，茯苓10 g，白术10 g，山药10 g，茵陈15 g，薏苡仁30 g，莪术15 g，石打穿15 g，半枝莲15 g，丹参15 g，苦参10 g。该方水煎后将药液浓缩，得到生药量为2 g/mL的药液。给予实验组大鼠灌胃健脾活血药液，以成人剂量为标准，经体表面积换算得到给药剂量，以4倍量给药，即约18 mL/(kg·次)，2次/d，连续给药7 d，末次给药1 h后使用异氟烷进行气体麻醉，无菌条件下从心脏取血，以300 r/min离心20 min分离血清，0.22 μm无菌滤器过滤后在56℃水浴锅中灭活30 min，分装后作为实验组血清，置于-80℃冻存备用。对照组大鼠按以上程序以等量生理盐水灌胃，取血清为对照组血清，冻存备用。

1.5 含药血清的干预及相关指标的检测 实验过程中将SMMC-7721细胞分为实验组及对照组进行相应的干预。

1.5.1 含药血清对缺氧状态下SMMC-7721细胞活性以及增殖能力的影响：分别使用MTT法与EdU试剂盒测定含药血清对缺氧状态下SMMC-7721细胞活性以及增殖能力的影响。(1)MTT实验。将对数生长期的SMMC-7721细胞消化计数，用培养基调节细胞浓度至2.5×104个细胞/mL，96孔板中每孔加入200 μL细胞悬液，待细胞贴壁后分别换用含实验组血清、对照组血清的RPMI-1640培养基(血清浓度为10%)，并加入细胞培养级氯化钴至最终浓度为150 μmol/L，以模拟TACE术后癌细胞缺氧状态。实验组与对照组血清各10组，每组做3个复孔。5% CO2、37℃培养72 h后，每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，继续培养4 h。随后将培养基吸弃，每孔加入150 μL二甲基亚砜，37℃条件下振荡10 min使结晶充分溶解，使用酶联免疫检测仪测定各孔在490 nm波长处的A值。(2)EdU实验。将SMMC-7721细胞以同样的密度接种于96孔板，贴壁后分别换用含实验组血清、对照组血清的RPMI-1640培养基(血清浓度为10%)，并加入氯化钴模拟细胞缺氧状态。实验组与对照组血清各10组，每组做3个复孔。72 h后按照1 000 ∶1的比例在培养基中加入EdU试剂继续培养，4 h后弃去培养基并用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞，使用4%多聚甲醛固定30 min，甘氨酸溶液孵育5 min，使用0.5% TritonX-100穿透细胞。随后每孔加入100 μL 1×Apollo避光染色30 min，磷酸缓冲盐溶液洗涤后使用1×Hoechst 33342反应液染细胞核30 min，在倒置荧光显微镜下观察拍照。通过计算实验组或对照组视野内的增殖细胞(Apollo染色为红色荧光，Hoechst染色为蓝色荧光)数量占总细胞数量的百分比来判定细胞增殖率。

1.5.2 含药血清对缺氧状态下SMMC-7721细胞侵袭迁移能力的影响：使用Matrigel基质胶包被的Transwell小室测定SMMC-7721细胞的侵袭迁移能力。实验前使用50 mg/L的Matrigel稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃环境下过夜风干。取对数生长期SMMC-7721细胞消化重悬，调整密度至2×105个细胞/mL，加100 μL细胞悬液至Transwell上室。24孔板下室每孔分别加入600 μL含实验组血清、对照组血清的RPMI-1640培养基(血清浓度为10%)，并在上室中加入氯化钴模拟细胞缺氧状态，37℃、5% CO2环境下培养24 h。24 h后取出小室，用棉签将上层基质胶与未迁移的细胞擦除，磷酸缓冲盐溶液洗涤后甲醇固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，再次用磷酸缓冲盐溶液漂洗后，镜下观察SMMC-7721细胞侵袭迁移到下室的细胞数量。实验重复3次。

1.5.3 含药血清对SMMC-7721细胞分泌uPA的影响：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清中uPA的含量。分别使用含实验组血清、对照组血清的RPMI-1640培养基(血清浓度为10%)培养SMMC-7721细胞，实验组与对照组血清各10个孔；72 h后取上清，离心去除沉淀后-20℃保存备用。将浓度为62.5～4 000 pg/mL的梯度浓度标准品与稀释5倍后的细胞培养液上清液加入预包被抗人uPA抗体的96孔板中，每孔加入100 μL，37℃反应90 min，使其中的uPA与抗体结合；随后每孔加100 μL生物素标记的抗人uPA抗体，37℃反应60 min，磷酸缓冲盐溶液洗涤3次后加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液100 μL反应30 min。最后每孔加入90 μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色液避光反应30 min，加100 μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺终止液终止反应后，使用酶标仪测定450 nm波长处的A值。

1.5.4 含药血清对SMMC-7721细胞上清HGF水平的影响：采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞培养液上清中HGF的水平。细胞上清的制备同1.5.3。将浓度为125～8 000 pg/mL的梯度浓度标准品与稀释5倍后的细胞培养液上清液加入预包被抗人HGF抗体的96孔板中，每孔加入100 μL，37℃反应90 min，使其中的HGF与抗体结合；随后每孔加100 μL生物素标记的抗人HGF抗体，37℃反应60 min，磷酸缓冲盐溶液洗涤3次后加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液100 μL反应30 min。最后每孔加入90 μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺显色液避光反应20 min，加100 μL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺终止液终止反应后使用酶标仪测定450 nm波长处的A值。

1.5.5 含药血清对SMMC-7721细胞c-Met蛋白表达水平的影响：采用免疫印迹试验检测SMMC-7721细胞上清c-Met蛋白表达水平。分别使用含实验组血清、对照组血清的RPMI-1640培养基(血清浓度为10%)培养SMMC-7721细胞，实验组与对照组血清各10个孔。72 h后，吸弃培养基并使用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，每孔加入400 μL含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min后使用细胞刮收集细胞，4℃环境下以12 000 r/min离心5 min后收集上清。以含50 ng总蛋白的溶液体积为上样量进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后转聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，c-Met一抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液漂洗3次，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST缓冲液漂洗3次。等体积混合电化学发光底物中的A液与B液，每平方厘米膜使用0.1 mL工作液，室温下孵育1～2 min。置于Tanon-5200化学发光分析系统内显影，选用β-肌动蛋白为内参蛋白。

1.5.6 含药血清对SMMC-7721细胞HGF与c-Met mRNA表达的影响：采用实时荧光定量PCR检测HGF与c-Met mRNA的表达水平。分别使用含实验组血清、对照组血清的RPMI-1640培养基(血清浓度为10%)培养SMMC-7721细胞72 h，实验组与对照组血清各10个孔。取实验组与对照组各约1×107个细胞，与1 mL TRIzol试剂一并加入离心管中，充分吹打，室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿，震荡15 s后静置2 min，4℃环境下以12 000 r/min离心15 min，取上层水相。加入0.5 mL异丙醇后混匀，室温静置10 min，4℃下再次12 000 r/min离心10 min，弃去上清。向沉淀中加入1 mL 75%乙醇，洗涤沉淀，4℃下7 500 r/min离心5 min，弃上清。沉淀自然干燥后，使用适量焦碳酸二乙酯水溶解待用。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参。HGF上游引物序列为5′-GAGAGAGGCGAGGAGAAACG-3′，下游引物序列为5′-GTGTAGCCCCAGCCGTAAAT-3′；c-Met上游引物序列为5′-ACGTACGGTGTCTCCAGCAT-3′，下游引物序列为5′-CTGGAGACACAGGATAGGAA-3′；GAPDH上游引物序列为5′-CTCAGTTGCTGAGGAGTCCC-3′，下游引物序列为5′ATTCGAGAGAAGGGAGGGCT-3′。利用引物与脱氧核糖核苷三磷酸合成cDNA后，使用QuantStudio实时荧光定量PCR系统进行实时定量PCR，反应体系为SYBR Green 1染料10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸0.5 μL，Taq酶1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 32.5 μL。反应条件为93℃ 2 min，然后93℃ 1 min，55℃ 2 min，共40个循环。反应结束后得到目的基因/内参基因Ct值，使用2-△△Ct法对RNA水平进行相对定量。△△Ct =[待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均 Ct 值]-[对照组目的基因平均 Ct 值-对照组内参基因平均 Ct 值]。

1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组SMMC-7721细胞活性以及增殖能力比较 实验组SMMC-7721细胞的A值及细胞增殖率均低于对照组(均P<0.05)，见表1及图1。

表1 两组SMMC-7721细胞A值及细胞增殖率比较(x±s)

图1 两组SMMC-7721细胞的增殖能力

注：Apollo染料将增殖细胞的细胞核染为红色荧光，Hoechst染料将所有细胞的细胞核染为蓝色荧光，Merge为融合图像，图中标色标尺为50 μm。

2.2 两组SMMC-7721细胞侵袭能力比较 实验组SMMC-7721细胞迁移到下室的细胞数量为(147.807±24.213)个，少于对照组的(362.945±32.735)个(t=29.734，P=0.001)。

2.3 两组细胞培养液上清HGF水平及细胞中c-Met蛋白表达水平的比较 实验组细胞培养液上清HGF水平及细胞中c-Met蛋白表达水平均低于对照组(均P<0.05)，见表2及图2。

表2 两组细胞培养液上清HGF水平及细胞中c-Met蛋白表达水平比较(x±s)

图2 两组c-Met蛋白表达情况

2.4 两组细胞HGF与c-Met mRNA相对表达水平比较 实验组细胞HGF与c-Met mRNA的相对表达水平均低于对照组(均P<0.05)，见表3。

表3 两组细胞HGF与c-MetmRNA相对表达水平比较(x±s)

2.5 两组细胞uPA分泌水平比较 实验组上清液uPA浓度为(667.356±103.103)pg/mL，低于对照组的(1 273.467±117.207)pg/mL(t=14.139，P=0.001)。

3 讨 论

原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，具有较高的死亡率。近年来TACE术治疗肝癌的短期疗效已经得到普遍肯定，广泛用于临床。但有研究表明，TACE术后复发转移概率较高，长期疗效尚不确定[13-15]。目前，有越来越多关于癌症的研究专注于深度挖掘中药古方，有研究表明，健脾活血方有助于降低肝癌术后的复发转移率[16]。因此本研究探究健脾活血方在减少肝癌术后的复发转移中的作用，以及可能的机制。

由于肝癌TACE术后靶动脉闭塞，肿瘤组织处于缺血缺氧的环境，其生物学行为势必发生改变[17-18]。为充分模拟这一变化，本研究首先在体外使用细胞培养级氯化钴来诱导肝癌细胞系SMMC-7721的化学缺氧状态[19]。MTT实验与Edu实验结果显示，实验组SMMC-7721细胞的A值及细胞增殖率均低于对照组(均P<0.05)，提示在缺氧状态下，健脾活血方含药血清可抑制SMMC-7721细胞的活性及增殖能力。而低活性与增殖能力的癌细胞可降低癌症的复发率，因此健脾活血方或可降低肝癌TACE术后的复发率。此外，Transwell实验结果显示，实验组侵袭迁移到下室的SMMC-7721细胞数量少于对照组(P<0.05)，这提示在缺氧状态下，健脾活血方含药血清可以降低SMMC-7721细胞的侵袭迁移能力。因此TACE术后应用健脾活血方或能降低肝癌术后的转移率。

HGF/c-Met信号通路参与多种肿瘤细胞的增殖、运动。本实验结果显示，实验组细胞培养液上清HGF水平及细胞中HGF mRNA表达水平、c-Met蛋白及其mRNA表达水平均低于对照组(均P<0.05)，提示在健脾活血方含药血清的作用下，SMMC-7721细胞的HGF及其受体c-Met的表达下调，HGF/c-Met通路被抑制。前期研究已经证实，uPA主要参与细胞外基质的降解，在肝癌的复发、转移中起到了重要作用[20]。本研究的酶联免疫吸附试验结果显示，实验组上清液uPA浓度低于对照组(P<0.05)，表明健脾活血方含药血清可降低SMMC-7721细胞分泌uPA的水平，从而阻止SMMC-7721细胞外基质的降解，进而抑制肿瘤细胞的转移能力。以上结果表明健脾活血方或通过抑制HGF/c-Met通路、调控细胞分泌uPA的水平，阻止肝癌的复发和转移。

综上所述，健脾活血方含药血清能够抑制缺氧状态下肝癌细胞的活性及增殖能力。其机制或为通过抑制HGF/c-Met通路并减少肝癌细胞分泌uPA的水平，抑制肝癌细胞的侵袭与迁移。由于健脾活血方成分较为复杂，下一步研究可以更加深入地分析药物成分及其作用，为改善肝癌患者预后提供更多理论依据。