基于生物信息学分析筛选骨关节炎差异表达基因▲

何 熠 熊海风 李毅成 方德鹏 余 雪 杨 渊,

(1 广西医科大学附属埌东医院，南宁市 530021，电子邮箱：361040956@qq.com；2 广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科，南宁市 530013，3 广西桂林市人民医院高压氧科，桂林市 541000)

骨关节炎是最常见的慢性关节病之一，患者不仅长期处于疼痛状态，还会逐渐丧失关节功能和活动性。骨关节炎是最常见的关节炎形式，随着时间的推移，软骨磨损加重，病情会恶化。虽然关节软骨破裂是骨关节炎的主要特征，但其他关节组织包括滑膜和软骨下骨，也共同参与了疾病的进展。目前尚无可以阻止骨关节炎进展并逆转损害的药物[1-2]。骨关节炎的主要治疗目标是控制疼痛和改善关节功能。常用的治疗药物包括非甾体抗炎药、局部给药的皮质类固醇和黏弹性补充剂。对于许多患者而言，由于缺乏有效药物而出现进行性软骨损伤，最终需要手术干预。

作为关节结构的一部分，滑膜可以产生滑液，维持关节活动。在许多关节疾病中也同时存在滑膜病变，其在促进疾病的发生和发展中起作用[3]。流行病学研究表明，胫骨和股骨的软骨损伤进展或与炎性滑膜存在一定的联系[4-5]，而滑膜组织及其分泌的滑膜液在骨关节炎的病理发展中起重要作用[4，6]。骨关节炎的病因复杂，由多种因素共同作用，包括遗传因素、关节损伤、肥胖和老化[7]。了解遗传易感性的生物学机制不仅可以为研究疾病的发病机制提供新思路，而且还可以开发出能够减缓或阻止疾病进展的新疗法。近年来，高通量基因芯片在疾病的分子诊断、分类、预后评估等方面应用广泛，这为研究骨关节炎的发病机制和分子诊断提供了新途径[8-9]。有学者使用骨关节炎样品和匹配的对照样品开发了基因表达文件GSE1919，建立了人骨关节炎的分子分类；基于差异基因表达分析、亚类预测和通路分析，发现根据基因表达数据和不同预后，可将骨关节炎患者分为具有不同遗传特征的亚组[10]。本研究对骨关节炎滑膜组织基因芯片数据(GSE1919)进行生物信息学分析，旨在更好地了解骨关节炎的分子机制，为该疾病的诊断和治疗提供有价值的信息。

1 资料与方法

1.1 基因芯片数据 于GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)下载骨关节炎滑膜组织基因芯片数据集GSE1919，该数据集基于Affymetrix Human Genome U95A Array平台，共包括5例骨关节炎滑膜样本(骨关节炎组)及5例健康对照滑膜组织(对照组)。

1.2 数据预处理和差异表达基因的筛选 利用R语言的数据差异分析工具包Limma对数据进行差异分析，筛选差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)，设置筛选阈值为P<0.05，差异倍数(fold change,FC)≥2。利用Affy工具包对基因探针与基因库中的基因名进行匹配，如果多个探针对应同一基因名，则取其平均表达值。

1.3 功能富集分析 利用DAVID在线分析数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析，从分子功能、细胞成分和生物过程3个层面对上调的DEGs进行归类，以进一步了解其相关功能。同时，利用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库(https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)对上调的DEGs进行信号通路分析，以了解导致骨关节炎滑膜病变主要的信号通路，富集基因数>2、P<0.05被认为差异具有统计学意义。

1.4 蛋白互相作用网络分析 基于STRING数据库(https://string-db.org/)信息识别蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)，使用Cytoscape软件3.4.0(http://www.cytoscape.org/),通过3种[包括等级(Degree)、最大集团中心性(maximal clique centrality，MCC)、最大邻域组分(maximal neighbourhood component，MNC)]不同的算法构建3个PPI网络。使用CytoHubba插件进行PPI网络的拓扑分析。参数设置为无重量的网络，结果按降序排列，包括学位中心性、中介中心性和亲密度中心性， 具有前20个最高中心的节点被视为中枢基因。

2 结 果

2.1 DEGs的筛选结果 与对照组相比，在骨关节炎组中共有1 145个DEGs，包括483个上调的DEGs和662个下调的DEGs，其中上调的DEGs包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-8、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)。 DEGs的火山图如图1所示，热图如图2所示。

图1 GSE1919样本集中的DEGs的火山图 图2 GSE1919样本集中的DEGs的热图

2.2 功能富集分析结果基因本体富集分析 结果显示，在分子功能方面，上调的DEGs主要涉及受体活性、细胞黏附分子活性；在细胞成分方面，上调的DEGs主要集中于细胞膜、细胞外成分、细胞外间隙等；在生物过程方面，上调的DEGs主要与细胞通信、信号转导有关。见表1。KEGG通路分析结果显示，上调的DEGs显著富集于磷脂酰肌醇-3-羟激酶-蛋白激酶B、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、细胞因子受体相互作用、TNF信号通路、黏着斑以及细胞黏附分子等信号通路。见表2。

表1 骨关节炎患者中上调的DEGs的基因本体富集分析结果

表2 骨关节炎患者中上调的DEGs的KEGG通路分析结果

2.3 PPI网络分析结果 通过3种不同的算法构建了3个PPI网络，得到了相似的结果。IL-6、IL-8、IGF、AGT在PPI网络中显著上调。见图3。

图3 骨关节炎患者中上调的DEGs的蛋白与蛋白相互作用

3 讨 论

近年来，人们对骨关节炎进展所涉及的因素及机制的认识明显提高。目前，学界认为骨关节炎不是单一的疾病，而是多种机制共同作用的最后阶段，其初始阶段可以由许多因素触发和延续[11]。根据此观点，骨关节炎可分为多种亚型，部分亚型可能出现更多的生化及炎症反应，或表现出更多的遗传特征，但所有这些亚型最终都会聚合到共同的表型中。然而，骨关节炎病理事件的确切顺序还不清楚，其中软骨下骨损伤、滑膜组织慢性炎症和软骨侵蚀之间的时间关系仍未知[12]。

本研究对来自骨关节炎患者的关节软骨样品和正常样品进行了全面的微阵列芯片分析，最终筛选出483个上调的DEGs，其中包括TNF、IL-6、IL-8、IGF、AGT；DEGs主要与细胞通信、信号转导等生物过程有关；DEGs在TNF信号通路、细胞黏附分子、丝裂原活化蛋白激酶等信号通路途径中显著富集。

TNF通路被认为是参与驱动炎症级联反应的主要通路。TNF由软骨细胞、单核细胞、成骨细胞和滑膜组织产生，可诱导产生许多炎症和分解代谢因子。在骨关节炎患者中，TNF水平在滑液、滑膜、软骨下骨和软骨中明显升高[13]。TNF可以通过独立或协同作用特异性地结合两种特定细胞膜上的受体，即TNF受体Ⅰ(p55)和TNF受体Ⅱ(orp75)。与正常细胞相比，骨关节炎软骨细胞和滑膜成纤维细胞中p55表达增加[14]。p55可能是在关节组织细胞中负责介导TNF活性的主要受体，但两种受体类型均被认为积极参与信号转导，并与不同的细胞内蛋白质级联相关[15]。因此，TNF通路激活可能在骨关节炎发生发展中起关键作用，可作为骨关节炎多种生物学过程的潜在治疗靶点。

IL-6及IL-8是骨关节炎患者关节软骨分泌的炎症因子，是扰乱代谢的关键介质，且可增强受累关节组织的分解代谢。既往有研究表明，IL-6和IL-8的高表达是诱导炎症组织中B细胞应答增加的重要免疫病理因素[16]。Franckhauser等[17]指出，慢性升高的IL-6及IL-8水平可能导致骨骼肌糖代谢紊乱和器官炎症。在本研究中，IL-6和IL-8是PPI网络中显著上调的中枢基因。 基于上述研究结果，我们推测IL-6可能作为主要促炎细胞因子，参与骨关节炎的发生过程。

AGT是一种α-2-球蛋白，主要由肝脏产生并释放到血液循环中，并在肾脏分泌的血管紧张素原酶作用下转变为血管紧张素Ⅰ；随后，其被血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)切割，生成血管紧张素Ⅱ[18]。有证据表明，肾素-血管紧张素系统的局部成分在肥大的软骨细胞中表达，而在透明软骨细胞中则不表达，提示该系统可能在软骨细胞退变中发挥作用[19]。有证据表明ACE抑制剂(雷米普利)可以改善类风湿性关节炎患者的血管功能[20]。然而，很少有研究直接显示ACE抑制剂对骨关节炎的影响。在本研究中，AGT基因在骨关节炎患者中上调，且AGT是PPI网络中的中枢蛋白，这与既往的研究结果[8-9]相似。因此，AGT可能在骨关节炎的发生和进展中起关键作用，但这仍需要进一步的验证。

IGF-1和IGF-2是控制宫内和出生后身体生长和发育的重要生长因子。Ni等[21]研究发现，通过产前乙醇暴露建立宫内发育迟缓大鼠模型，与对照组相比，产前乙醇暴露组成年后代软骨破坏增加，骨关节炎进展加快；免疫组织化学结果显示，IGF-1信号传导途径组分的表达降低，这与产前乙醇暴露组中胎儿骨骺软骨中Ⅱ型胶原减少的变化一致。该研究表明，产前乙醇暴露可下调血液IGF-1和局部软骨IGF-1信号水平，导致关节软骨发育不良，增加骨关节炎易感性。但是，IGF-1和骨关节炎之间的确切关系鲜有研究报道。 在本研究中，IGF基因是PPI网络中最重要的中枢基因,其可能在软骨Ⅱ型胶原代谢过程中起作用。

DEGs鉴定和深入分析可能有助于确定骨关节炎发病机制中的有用靶点和途径。IL-6、IL-8、IGF和AGT基因可能是参与骨关节炎发展的重要基因，这或可为骨关节炎治疗靶点的研究提供新的见解。本研究的局限性在于筛选的基因和途径未经实验验证，这可能成为未来研究的焦点。