腐殖酸钠复合吸附剂吸附玉米赤霉烯酮的筛选及效果

许 静，齐德生

（1.河南省安阳市文峰区农牧水利局，河南 安阳 455000；2.华中农业大学动物科学技术学院，湖北 武汉 430070）

联合国粮农组织调查显示，每年全世界谷物大约有25%受到霉菌毒素污染[1]，已知全世界能产生霉菌毒素的霉菌有150种，产出200种霉菌毒素[2]，其中玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是污染饲料的主要霉菌毒素之一。Placinta等[3]对二十多个国家调查研究显示，大部分国家的谷物和动物饲料都不同程度地受到ZEN的污染。Stob等[4]最早从长霉的玉米(Zea mays)中分离得到玉米赤霉烯酮，Jean将ZEN感染植物过程分为田间霉菌以及储藏霉菌两类。此后玉米赤霉烯酮的污染及危害就越来越引起人们的重视。2017年上半年，刘凤芝等[5]对我国部分地区饲料和饲料原料的ZEN污染状况进行统计分析，结果显示在全部356份样品中，ZEN检出率高达 95%，ZEN 平均含量为 698.0 μg·kg-1。玉米赤霉烯酮是2, 4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，非类固醇结构，具有类雌激素样性能，可与体内雌激素受体相结合，产生雌激素效应，造成生殖激素紊乱，引起流产、死胎等，同时还会导致肝肾功能损、免疫抑制等[6-8]。玉米赤霉烯酮(ZEN)能造成动物急慢性中毒，影响动物生长性能及造成生殖疾病等，对动物健康有严重的危害。广泛分布于小麦(Triticum aestivum)等粮食作物、畜禽饲料和土壤中，玉米赤霉烯酮毒素能在畜产品中残留，其危害和所造成的巨大经济损失已是不容忽视的问题。所以，如何有效消除玉米赤霉烯酮毒素的危害是非常必要的研究课题。

霉菌毒素脱毒方法目前分为4种，分别是物理脱毒、营养脱毒、生物脱毒和化学脱毒[9-11]。在长久以来的研究中，用物理、生物、化学和营养的方法去除饲料中的霉菌毒素，存在很多不足，如生产加工困难，破坏饲料中的养分，原料不易获得，去毒不彻底等。目前，生产上应用比较普遍的是物理吸附法，但是存在吸附效果不好，去除毒素单一等缺点，ZEN去除问题并没有得到很好解决。腐殖酸钠是以风化煤、泥炭和褐煤为原料经特殊工艺加工制成的一种具有多种功能的大分子有机弱酸钠盐，其结构比较复杂，已知腐植酸分子中含有苯环、稠环和某些杂环(如吡咯、呋喃、吲哚等)，各芳香环之间有桥键相连，芳香环上有各种功能基团，主要是羧基、酚基、羟基、甲氧基、醌基等[12]。腐殖酸钠中腐植酸干基含量超过75%，是一种生产绿色乳肉蛋食品用的良好兽药和饲料添加剂[13-15]。国内外关于腐殖酸钠吸附纯品ZEN的基础性试验研究报道极少。为此，研究腐殖酸钠对ZEN的吸附效果，并分析不同反应体系下对腐殖酸钠去除ZEN的影响，以期为腐殖酸类霉菌毒素吸附剂的实际应用提供理论依据。

1 试验材料

吸附剂：腐植酸钠、沸石(Zeolite)、凹凸棒(Palygorskite)、高岭土(kaolin)、膨润土(Bentonite)、活性炭、麦饭石(Medical stone)、硅藻石(Biatomite)；β-葡聚糖(β-Glucan)。玉米赤霉烯酮标准品含量大于99%，购自Sigma。高效液相色谱仪(Sinochrom ODS-BP)，美国安捷伦科技有限公司。恒温水浴振荡器、离心机；甲醇、乙腈，均为色谱纯，购自Fisher scientific。磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸；去离子水。

2 试验方法

2.1 最佳脱毒剂筛选及反应体系条件的影响

2.1.1 腐殖酸钠与不同吸附剂复合试验

将腐殖酸钠与其他脱毒剂(沸石、凹凸棒、高岭土、膨润土、活性炭、硅藻石，β-葡聚糖)分别按1∶3、1∶1、3∶1这3个比例进行复合，空白组不添加吸附剂，然后进行去ZEN试验，每个处理3个重复，取平均值，筛选出复合之后效果最佳的吸附剂。

2.1.2 复合脱毒剂最佳比例筛选

分别将腐殖酸钠与在2.1.1筛选出的最佳配合物设置不同比例，分别为6∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶6，空白组不添加吸附剂，进行去除ZEN试验，每个处理3个重复，取平均值，筛选出最佳比例，配制成复合剂G(G代表最佳)，记录数据。

2.1.3 反应条件对复合物G吸附ZEN的影响

分别设置不同的吸附剂添加量(5、10、15、20、25 mg)、pH(2、5、7、8)、震荡时间 (30、60、90、120 min)、温度 (20、37、60 ℃)，其他试验条件一致，离心之后高效液相色谱法测定上清液中玉米赤霉烯酮含量，进而计算吸附量和吸附率。

2.1.4 复合剂G等温吸附试验

精确称取20 mg复合剂G于离心管中，分别加入 0.5、2、3、4、5 和 6 μg·mL-1ZEN 标准溶液20 mL，在 pH 为 7 的条件下，37 ℃ 120 r·min-1的恒温振荡水浴锅上振荡反应90 min。反应结束后于5 000 r·min-1离心10 min，并收集上清液，HPLC法测定上清液中剩余ZEN的含量，分别计算脱毒量和脱毒率。以脱毒反应体系中霉菌毒素的浓度为横坐标，脱毒量为纵坐标，绘制等温脱毒曲线。

2.1.5 复合剂G-ZEN解析试验

等温脱毒试验结束后，倾去上清液，在初始浓度为1 μg·mL-1ZEN离心管中分别加入10 mL pH为7的磷酸缓冲液、三氯甲烷、人工模拟胃液和人工模拟肠液作解吸液，在37 ℃ 120 r·min-1的恒温振荡水浴锅上振荡处理30 min，然后离心测定ZEN含量，经残液校正后，计算解吸率。解吸过程重复3次，求累积解吸率。

2.2 数据统计及分析

2.2.1 脱度量及脱毒率的计算

式中：Q为脱度量(μg·g-1)；Y为脱毒率(%)；V为溶液的体积(mL)；m为腐殖酸钠的用量(mg)；CO为ZEN初始浓度(μg·g-1)，C分别为反应后ZEN的浓度 (μg·g-1)。

2.2.2 ZEN含量的测定

样品经三氯甲烷萃取、浓缩、净化后，ZEN含量经荧光分光光度法测定[16]。

2.2.3 统计分析

用SPASS软件进行数据处理和分析，方差分析显著者则进行Duncan's法多重比较，结果用“平均值 ± 标准误”表示。

3 结果与分析

3.1 腐殖酸钠与其他脱毒剂复合结果

在统一试验条件下，腐殖酸钠与其他脱毒剂在3种比例之下进行复合之后，对ZEN去除效果如表1所列。

腐殖酸钠与沸石、麦饭石、葡聚糖、高岭土、膨润土等吸附剂进行复合，对ZEN去除效果较不理想，脱毒率在10%～64%，但是腐殖酸钠与活性炭对ZEN的脱毒率高达97.3%，此时腐殖酸钠与活性炭比例为1∶1(表1)。因此本研究选取腐殖酸钠与活性炭进行复合试验。

表1 腐殖酸钠与其他脱毒剂复合结果Table 1 Results of a complex experiment between humic acid sodium and commonly used adsorbents

3.2 腐殖酸钠与活性炭最佳比例筛选

由3.1 筛选出最佳脱毒剂组合，进行不同比例的复合，研究不同比例的腐殖酸钠与活性炭复合剂去除ZEN效果，结果如表2所列。结果显示，在考察范围内，随着腐殖酸钠比例的降低，复合剂的脱毒效果先递减，但当腐殖酸钠与活性炭比例为2∶1时，对ZEN的脱毒率高达99.62%，ZEN几乎全部被去除，效果最好，所以选取腐殖酸钠：活性炭=2∶1时为最佳脱毒比例。

表2 不同比例的腐殖酸钠与活性炭复合去除ZEN的效果Table 2 Detoxification of ZEN by different proportions of sodium humic acid and an activated carbon compound

3.3 复合剂G体外试验结果

3.3.1 复合剂G添加量对吸附的影响

通过分别添加5、10、15 mg复合剂G，测定不同添加量对复合剂G吸附ZEN的影响，结果如表3所列。

表3 复合剂添加量对ZEN吸附的影响Table 3 Effects of the amount of compound adsorbent on the detoxification of ZEN

在考查脱毒剂量范围内，随着复合剂的增加，复合剂对ZEN的脱毒作用随之增强。但当复合剂用量增加到15 mg时，复合剂对ZEN的脱毒量达到最大(652.87 μg·g-1)，继续增加复合剂用量，复合剂对ZEN 的脱毒量从 652.87 μg·g-1下降到 648.03 μg·g-1(P＞0.05)；试验结果显示，当复合剂添加量为15 mg时，复合剂对ZEN吸附效果达到最佳。

3.3.2 振荡时间对复合剂G吸附ZEN影响

通过设定不同振动时间，测定不同振荡时间对复合剂G吸附ZEN的影响，结果如表4所列。

表4 振荡时间对去除ZEN的影响Table 4 Effects of interaction time on the detoxification of ZEN

吸附过程中处理时间对去除ZEN是有一定影响的。随着处理时间的增加，复合剂对ZEN的脱毒率和脱毒量逐渐增加，但是当到60 min时，复合剂对ZEN的脱毒率及脱毒量达到了一个动态平衡。此后继续延长时间到120 min，复合剂对ZEN的脱毒率和脱毒量与60 min时差异不显著(P＞0.05)。因此，本研究选取60 min为最佳脱毒时间。

3.3.3 pH对复合剂G吸附ZEN影响

通过设定不同的pH的反应体系，测定不同pH对复合剂G吸附ZEN的影响，结果如表5所列。

表5 溶液pH对去除ZEN的影响Table 5 Effects of solution pH on the detoxification of ZEN

结果显示，在pH 2 ～7范围内，随着溶液pH的增加，复合剂对ZEN的脱毒作用逐渐增加；到pH为7时达到最大，继续增加溶液pH值，将会导致脱毒量由 650.81 μg·g-1降到 599.16 μg·g-1。由于复合剂是由无机物与有机物组成，其物化特性较为特殊，导致此类现象发生。说明了pH是影响脱毒剂去除ZEN的重要因素。

3.3.4 温度对复合剂G吸附ZEN影响

一般来说，低温有利于物理吸附，高温有利于化学吸附。温度对玉米赤霉烯酮毒素吸附的影响复杂，温度升高，腐殖酸钠分子热运动一般加快，此时大部分腐殖酸钠溶解度也会增加，不利于物理吸附。当温度为20、37、60 ℃时，复合剂对ZEN 的吸附量分别为 283.12、651.64、386.29 μg·g-1，差异显著(P＜0.05)，且与温度变化不呈线性关系(表6)，说明复合剂G对ZEN的吸附既有物理吸附，也存在化学吸附。

表6 处理温度对去除ZEN的影响Table 6 Effects of interaction temperature on the detoxification of ZEN

3.3.5 复合剂G等温吸附试验

在37 ℃恒温、pH 7、处理时间为60 min条件下，考察玉米赤霉烯酮初始浓度与脱毒效果间的关系。以脱毒反应体系中ZEN浓度为横坐标，脱毒量为纵坐标，得到复合剂对ZEN的等温脱毒曲线。复合剂对ZEN的脱毒量随着ZEN浓度的增大而逐渐增加，并且在考察浓度范围内，复合剂对ZEN 的最大毒量高达 961.42 μg·g-1(表7)。

表7 ZEN初始浓度对去除ZEN影响Table 7 Effects of initial concentration of ZEN on the detoxification of ZEN

3.3.6 复合剂G-ZEN复合物解析试验

三氯甲烷、PBS、人工模拟胃液、人工模拟肠液对ZEN-复合剂中ZEN的解吸率分别为3.17%、4.39%、6.39%和5.06%，都在20%以下(表8)，表明ZEN8在这些复合物中的稳定性较高，同样意味着它们对ZEN可能存在化学吸附。

表8 复合剂-ZEN复合物的稳定性Table 8 Stability of the compound adsorbent-ZEN complex

3.3.7 复合剂G等温试验结果拟合Langmuir与Freundlich方程

由回归方程的拟合度系数(表9)看，复合剂对ZEN的等温吸附既符合Langmuir方程，也符合Freundlich方程，但Freundlich方程的拟合程度(R2=0.973 9)大于 Langmuir方程的 (R2=0.961 8)。

4 讨论

4.1 3种吸附剂效果评价

本研究中，在体外统一试验条件下，腐殖酸钠与活性炭比例为2∶1复合成复合剂G时，对ZEN脱毒效果达到95.62%，而单独使用腐殖酸钠与活性炭的脱毒率分别为78.5%和69.17%。这3种吸附剂对ZEN吸附效果排序为：复合剂G＞腐殖酸钠＞活性炭。复合剂G对ZEN的吸附在60 min达到一个吸附平衡，而腐殖酸钠需用90 min才达到平衡，说明复合剂G能更快地吸附ZEN。

表9 Langmuir与Freundlich回归方程Table 9 Regression equation of Langmuir and Freundlich isothermal

4.2 处理因素对吸附ZEN效果影响

4.2.1 溶液pH

有报道指出，霉菌毒素脱毒剂去除霉菌毒素效果，取决于脱毒剂的物质结构特性以及霉菌毒素的物理和化学性质[17]。当溶液pH值较低时，由于此时溶液中存在大量的H+，腐殖酸钠表面的作用位点被H+大量占据，这就减少了腐殖酸钠与ZEN的作用位点；同时，H+和ZEN的竞争效应，H+能与腐殖酸钠表面的不饱和离子发生离子交换作用，使得对ZEN吸附效果差。已知ZEN分子中含有2个酚氢基，等电点为7.16[18]，在溶液pH＜7.16时，ZEN主要呈弱酸性，所以当pH=2、5时复合剂G对ZEN的脱毒作用较弱，此时复合剂G可能以物理方式吸附ZEN。随着pH的增加，溶液中H+减少，与复合剂G竞争作用减弱，同时腐殖酸钠中酚羟基等活性基团的H+解离，使得复合剂G对ZEN的吸附能力增强。

4.2.2 试验温度

本研究中，吸附剂在20 ℃和37 ℃条件下，37 ℃和60 ℃条件下的吸附情况不一致。这反映出腐殖酸钠与复合剂G在低温下好。在37 ℃时，复合剂G吸附率达99%。在高于常温37 ℃时，腐殖酸钠吸附较差，原因极可能是吸附是以物理吸附为主。但是在高温时，复合剂G吸附率虽然吸附率有所下降，但是也达到了75.26%，说明复合剂G极也可能存在化学吸附，之所以吸附率会有所下降是原因可能是该化学反应是放热反应。

4.2.3 脱毒剂用量

本研究中，在一定范围内，随着腐殖酸钠和复合剂G用量的增加，腐殖酸钠及复合剂G对溶液中ZEN的脱毒作用逐渐增强，这与前人[19-21]关于霉菌毒素脱毒剂对霉菌毒素脱毒效果的影响结果一致。原因可能是吸附剂的添加量影响复合剂G与ZEN的有效作用位点结合。本研究结果显示，复合剂G添加剂量要少于腐殖酸钠的添加量，复合剂G更节省经济。

4.2.4 吸附稳定的时间

本研究中，腐殖酸钠吸附稳定的时间为90 min，而复合剂G吸附稳定的时间为60 min，此时达到了一个动态脱毒平衡。复合剂相对于单一吸附剂可以更快地达到吸附稳定。吸附平衡的时间越短，在动物体内吸附剂对ZEN的吸附作用越好，若吸附时间过长，吸附剂可能不会充分吸附饲料中的ZEN。

4.3 复合剂G对ZEN的吸附效果

在本研究体外试验中，添加1.5 mg·mL-1的复合剂G振荡60 min后检测结果，发现复合剂G对ZEN吸附量随着ZEN初始浓度增加而增加，考察范围内最高可达961.42 μg·g-1，这与前人[22]考察影响结果一致。

5 小结

在统一试验条件下腐殖酸钠、活性炭、复合剂G对ZEN脱毒率分别为78.5%、69.17%、95.62%，复合剂G对ZEN的吸附效果最佳，并经解析试验证明，复合剂G对ZEN吸附最为稳定。本研究结果为腐殖酸类ZEN吸附剂的实际应用提供了重要依据。