苜蓿黄萎病的发生、危害及检测

索南措，黄远志，李彦忠,2，俞斌华,2

（1.兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室/兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室/兰州大学草地农业教育部工程研究中心，兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；2.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010）

紫花苜蓿(Medicago sativa)是我国草产业的主要草种，在我国已有两千多年的栽培历史[1-2]。由于其营养价值高、适口性好、根系发达、再生性强、耐旱、抗寒、耐盐碱、适应性广的特点，是理想的饲料和水土保持植物，具有显著的生态效益和经济价值[3-4]。苜蓿是我国干旱半干旱地区生态建设和退耕还草的重要草种，在建设和保护生态环境[5]、调整种植业结构[6]、保持农业可持续发展等方面[7]均具有潜在的经济效益和重要的社会效益[8]。因其产量高、营养丰富(粗蛋白质含量可高达22%)，综合营养价值高于饲用玉米等，是奶牛养殖的理想饲料，是为我国人民提供优质健康原料奶的物质基础[9]，被誉为“牧草之王”[1]。21世纪初，西部大开发战略的实施，为我国苜蓿产业化发展拉开了序幕，伴随着京津风沙源治理、退耕还林还草、退牧还草等重大生态工程的启动和奶业的快速发展，我国苜蓿产业发展到了一个新的阶段，苜蓿在畜牧业发展、种植业结构调整和生态治理以及保障边疆地区经济繁荣中，发挥着越来越大的作用，苜蓿产业已成为草产业的支柱产业，畜牧业(特别是奶牛业)的基础产业，保障生态安全的重要产业，边疆地区的民族产业[3,9-10]。随着我国规模化、标准化奶牛养殖业的快速发展，对高品质植物性蛋白饲料的需求量将越来越大，苜蓿已成为不可替代的战略性保障饲草[11]，并且在我国种植面积非常广大。

据《全国苜蓿产业发展规划(2016-2020)》，截至2015年底，全国苜蓿保留面积7 067万亩(约471.1万hm2)，产量3 217万t；2016年底，全国苜蓿保留面积 6 562万亩(约437.5万hm2)，产量3 021万t，主要栽培于甘肃、内蒙古、新疆、宁夏、黑龙江、河北等省(区)，其种植面积占全国的89.8%，形成了甘肃河西走廊、内蒙古科尔沁草地、宁夏河套灌区等一批10万亩(约6 700 hm2)以上集中连片的优质苜蓿种植基地，是我国主要苜蓿种植区和种子生产基地，也是我国草食畜牧业主产区。

苜蓿栽培草地的种植规模和生产水平是衡量一个国家畜牧业现代化程度的重要标志[12]。然而目前我国苜蓿产业发展存在的突出问题是产不足需、质量水平不高[13-14]。我国畜牧业尤其是奶业的快速发展，使其对苜蓿的需求量逐年增加，而现阶段国产苜蓿无论在数量上还是在质量上，均无法满足畜牧业生产的消费需要[15-16]。2016年我国进口苜蓿近150万t，进口量是2008年的近80倍。据估计近年我国苜蓿约50%的需求总量仍需依赖进口。

诸多因素导致我国苜蓿供不应求的局面，其中包括机械化程度低、栽培技术不到位等，对苜蓿病害防治缺失也是造成草产量不高，草品质不佳的主要原因[14,17]。随着我国进口苜蓿种子和苜蓿草产品数量的激增(其中约90%来自北美)，以及我国栽培面积的扩大，外来入侵病害可能成为我国苜蓿生产的主要限制因素。

苜蓿黄萎病是世界上公认的苜蓿毁灭性病害，该病菌被我国列入《进境植物检疫性有害生物名录》(农业部第862号公告，2007年5月29日发布)中第276号检验对象。该病害最早于1918年发现于瑞典，1938年传入德国，二战之后在丹麦突然爆发，随后入侵荷兰、法国、英国等国家，继而向东欧、南欧扩展[18]。1962年加拿大两个农业研究站试验地发现该病害，由于扑灭及时，病害未能定植。1976年在美国华盛顿首次报道该病原菌侵害，并发现大量苜蓿黄萎病植株，随后病原菌在北美广泛蔓延，次年加拿大再次发现多处病田[19-20]，1986年传入日本[21]，1998年曾报道在我国新疆发生[22]。苜蓿黄萎病对北美地区苜蓿产业造成过巨大打击。

本研究综述了苜蓿黄萎病病原物的鉴定、病害的发生规律和侵染循环、病害的危险性、病害的检测和防治技术及流行与蔓延过程等内容，并对该病害的研究趋势以及在我国传播的风险性提出一定的展望。

1 苜蓿黄萎病的病原菌

黄萎病是由轮枝菌属(VerticilliumNees)真菌引致植株萎蔫枯死的一类病害，该属有黑白轮枝菌(V.albo-atrum)、大丽轮枝菌(V.dahliae)、苜蓿轮枝菌(V.alfalfae)、三体轮枝菌(V.tricorpus)、云状轮枝菌(V.nubilum)、长孢轮枝菌(V.longisporum)、V.zaregamsianum、V.isaacii、V.klebahnii以及V.nonalfalfae等10个种[23-25]，可侵染紫花苜蓿、红豆草(Onobrychis viciaefolia)、马铃薯 (Solanum tuberosum)、棉花(Gossypiumspp.)、啤酒花(Humulus lupulus)、草莓 (Fragaria×ananassa)、烟草 (Nicotiana tabacum)、番茄(Lycopersicon esculentum)、大豆(Glycine max)、花 生(Arachis hypogaea)、莴 苣(Lactuca sativa)等400余种农作物和杂草[26-31]。黑白轮枝菌和大丽轮枝菌是农业生产中最主要的2种病菌，其中黑白轮枝菌可寄生啤酒花、紫花苜蓿、黄瓜(Cucumis sativus)、鼠李属(Rhamnus)、天竺葵属(Pelargonium)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)等多种农作物，但不同寄主上的菌株存在不同融合型，2014年采用分子生物学手段将仅侵染紫花苜蓿的一类融合型描述为苜蓿轮枝菌 (V.alfalfae)[25,29,32](图1)。

苜蓿轮枝菌为维管束寄生菌，菌丝无色，直径2～4 μm，也产生暗色厚壁的休眠菌丝。由菌丝抽生轮状分枝的分生孢子梗。分生孢子梗有隔，基部呈暗色，有1～4个分枝轮，每个分枝轮有1～5 个分枝梗，分枝梗长短 14～38 μm(平均 28 μm)，顶端着生无色透明的分生孢子，孢子连续产生，聚集成球状。单个分生孢子椭圆形，大多数无隔，少数具 1隔，大小 (3.5～10) μm×(1.5～3.5) μm(平均均6.5 μm×2.4 μm)(图2)。苜蓿轮枝菌在 PDA 平板上产生大量的气生菌丝，1周后菌丝体由白色转变为乳白色，2～3周后为乳褐色，底部零星出现黑色的休眠菌丝。另外也有白色的扇变体产生。后期产生少量黑色休眠菌丝，未发现厚垣孢子和微菌核的结构。生长温度为15～30 ℃，最适温为20～25 ℃，高温30 ℃，33 ℃时即停止生长。病原菌对pH的适应性强，在pH为5.5～11.5的范围内均能生长，最适pH为6.5～9.5，但pH在3.5以下不能生长[32-33]。

图1 基于ACT, EF, GPD和TS构建的轮枝菌属基因系统发育树Figure 1 Phylogenetic relationship of the 10 Verticillium species based on the combined ACT, EF, GPD, and TS dataset of the 2 658 characters and 77 taxa with Gibellulopsis nigrescens as the outgroup

图2 苜蓿轮枝菌形态学特征Figure 2 Morphological features of Verticillium alfalfae

2 苜蓿黄萎病的侵染循环和发生规律

2.1 苜蓿黄萎病菌的越冬

苜蓿黄萎病菌以不同菌态在3种场所越冬：1)田间病株中的菌丝。菌丝可在病株的茎基部、根颈和主根中越冬，翌年植株返青后随着新枝从刈割残留的茎基部上生长，病菌扩展到新枝中，并随着枝条的伸长而扩展到其它组织。2)田间病残组织上的分生孢子。田间病残体上的分生孢子可存活16个月以上，成为田间病菌在植株之间扩展的途径，但随着时间的推移，分生孢子的死亡率显著增加。3)种子内的菌丝。虽然发病植株大多不开花结实，但发病轻的部分枝条也可能开花结实使种子携带病菌；也有报道分生孢子通过侵染健康苜蓿植株花期的柱头进入种子[34]。但大部分籽粒秕瘦，在种子收获处理中被淘汰，故饱满种子上的带菌率较低。由于带菌种子是病害远距传播的主要途径，在新建植的苜蓿地上，若使用带菌的种子，则会生长出带菌的幼苗，这些幼苗在生长后期死亡，病菌在死亡的幼苗上产生大量分生孢子，可能传播到临近植株上，故虽然种子的带菌率较低，但在新建植苜蓿地中，少量的带菌种子也会造成当地苜蓿黄萎病的迁入和持续危害[35-37]。该菌的分生孢子在土壤中存活时间尚不明确。

2.2 苜蓿黄萎病菌的传播

学者们对于苜蓿黄萎病菌的传播途径有不同观点，已明确病株上产生的种子携带此病菌，病菌在不同代的植株中传递，即通过种子带菌垂直传播。但也有学者认为该病菌在病株上可产生分生孢子，侵染苜蓿花期的柱头进入种子[37]，也可直接侵染健康的植株。收割后的苜蓿干草、苜蓿粉或苜蓿颗粒等饲料中也混杂病菌的分生孢子，可通过气流传播造成新的侵染[38]。也有学者提出，田间分生孢子浓度低、侵染性弱，并不能作为病害传播的主要方式[34,39]。但目前明确有以下几种传播方式：

1)人为远距调运带菌的苜蓿种子是造成新病区的主要途径。加拿大疫区的苜蓿种子带菌率为3.2%，美国疫区的苜蓿种子带菌率为8.7%[26,38]；种子越小，带菌率越高，当粒重小于1.28 mg时，带菌率可达7.8%[39]。病菌主要分布于种胚中，美国和加拿大的苜蓿种子内部带菌率约为0.4%[35,38-40]，种间混杂病株残体也可传播病菌[41-42]。

2)带菌的苜蓿种子播种后在田间形成发病中心，病菌在发病植株中越冬，次年再发病，直至植株死亡。外表健康的苜蓿种子内部带菌率虽然仅为0.03%[41]，但已可能在1 hm2的田间形成约750个初侵染点[43]。随着发病植株死亡，病菌进入土壤可长期存活，随流水、耕作农具、收获粉尘和污染运输工具而扩散至周围植株甚至更大的区域[44]。

3)传粉昆虫、害虫、捕食性昆虫等，都有可能成为病害传播的媒介，如苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)和苜蓿盲蝽(Adelphocoris lineolatus)等昆虫可传播此病菌[45]，豌豆蚜携带病原菌比例最高可达90%，切叶蜂切取病叶带到较远的地方，其他昆虫的足部、下腹部粘附黄萎病原菌的孢子，在传粉、取食、筑巢等活动中可能将黄萎病菌从病田传至未发病田，从而加速了苜蓿黄萎病的大面积扩散(图3)[24,26,38]。

图3 昆虫传播苜蓿黄萎病菌Figure 3 Insect dissemination of Verticillium albo-atrum

2.3 初侵染和再侵染

田间病株上产生的分生孢子是主要初侵染来源之一，在苜蓿生长季节可造成侵染，尤以苜蓿生长中后期部分病株(枝)死亡后遇到连日阴雨，空气湿度较大的条件下，有利于菌丝产孢、分生孢子萌发与侵染，因此秋季刈割后(刈割时机械损伤尤其利于孢子侵染，再生枝叶受侵染后病菌扩展到茎基部越冬)和春季返青后，可侵染茎、叶、叶柄等。土壤中的植物病残体和分生孢子是另一主要来源，通过侵入苜蓿根部完成初侵染。大部分年份田间植株的发病主要依赖于田间病株茎基部和根颈内存留的菌丝，而非病株上的分生孢子[19,22,46-47]。

2.4 流行规律

产孢条件：该病菌在5～30 ℃下在发病叶片、茎秆上均可产孢，而最适宜温度为25 ℃。病菌在枯死病枝、病叶上产孢量较大。

孢子萌发条件：孢子萌发需要高湿或水滴、水膜等有水的条件，在水中最适宜温度是20～24 ℃，完成萌发需要8～24 h。因为空气湿度是决定该病菌产孢和孢子萌发的主要条件，因此，凡是可形成高湿环境的因素均有利于病害的发生与危害，加快草地的衰退速度，如，栽培于降频繁且年降水量大的地区，经常灌溉、密植的田块等。另外，刈割收获时田间留存的死亡病株在适宜条件下可产生大量分生孢子，增加田间菌源数量，并且伴有大量机械损伤，大幅增加侵染概率[46-48]。

同一种病害在不同环境下的越冬、传播、侵染及发病条件等发病规律不尽相同，苜蓿黄萎病在我国发生规律的研究尚处于空白。

3 苜蓿黄萎病的危害

该病是世界上公认的苜蓿毁灭性病害，因此，该病菌被我国列入《进境植物检疫性有害生物名录》(农业部第862号公告，2007年5月29日发布)中第276号检验对象，其危险性体现在以下几方面：1)降低苜蓿草产量降低15%～50%，甚至绝收[49-50]，在美国发病第2年1 hm2苜蓿黄萎病田可损失苜蓿干草产量超过2.5 t，第2年晚期至第3年早期病株衰弱死亡[51-54]。2)降低苜蓿种子产量，发病植株大多不开花结实，使种子产量逐年急剧下降，降幅可达50%[55]，继而影响种子出口[56]。3)加速苜蓿草地早衰，发病田植株大量死亡，草地利用年限缩短为2～3年[21,57-58]。4)严重损害经济效益。由于苜蓿种子和草产品携带检疫病害，导致无法外销，无经济收益[56]，如美国哥伦比亚河流域成为苜蓿黄萎病的重病区后，苜蓿产业瓦解[18]。5)由于此病菌在土壤中长期生存，很难清除，发病田不能再播种苜蓿，至少需经过3年轮作后，存在于土壤中及凋落物中的病原菌才可能死亡。因而清除病原菌需要付出长期大量的工作，且经济投入高昂。发病田没有苜蓿根瘤菌的固氮作用，氮肥施用量也随之上升，使每公顷地生产成本增加162 USD[18,26]。6)将促使畜牧业、奶业等下游产业生产成本大幅增加，导致人类对畜产品的消费量明显降低[18,26,57]。虽然该病害在我国曾有过发生的报道，但其对草产量、种子产量和草地持久性等危害程度至今不详。

4 苜蓿黄萎病菌的检测与防治技术

快速诊断、准确检测是防治苜蓿黄萎病的前提。目前关于病害的检测方法众多，但各有优缺点。发现疑似黄萎病植株后，可以通过分离病原菌采用形态学和分子生物学的鉴定方法，此方法准确度较高，也是目前应用最广泛的一种方法，但从病原菌分离、纯化、培养到形态学和分子生物学鉴定，往往需要几周甚至一个月的时间，耗时非常多，不适用于海关进出口检疫对时间性的要求。采用RFLP、RAPD、PCR、RPA等技术检测，此方法优点是准确率较高，缺点是无法在田间或者基层生产中完成检测[19,54,59-62]。采用同工酶鉴定法，优点为方法简单实用，缺点为容易发生发生漏检、错检的现象，准确率相对较低，不能满足日趋繁忙的口岸检验要求[18,41]；采用基质辅助激光解吸电离技术(MALD-TOF-MS)、环介导等温扩增技术(LAMP技术)[63]检测，准确度很高，相应缺点为对操作的技术要求高，并且仪器设备昂贵、鉴定周期长、易产生假阳性等问题，不易在进境检验检疫中普遍推广使用。目前应该研究ELISA检测法，并研制相应试剂盒，通过酶联免疫吸附剂测定，可满足苜蓿黄萎病快速、大量检测的需要，并能够明显降低检测成本；由显色反应判断结果，较简单易行，可在基层生产和病害调查中使用。

作为一种检疫性病害，苜蓿黄萎病在防治上应以预防为主，需采取科学的方法对苜蓿种子和草产品进行检验，将病菌拦截在国门之外是最关键的措施。一旦该病害已发生，必须采取多种措施尽快铲除。美国、加拿大等国家首先采取隔离措施，禁止疫区苜蓿种子与草产品外销，能够在一定程度上减缓病害传播。同时还应做好农业机械的清洁工作，如收割机、打捆机、刀具等需要定时消毒，也能够有效降低病害在田间的传播速度。但化学防治方面，并没有非常有效的方法，如用甲基溴熏蒸后，植株凋落物中的病原菌仍然存活；用克菌丹、甲基托布津、苯菌灵、福美双等传统化学杀菌剂，仍然不能杀灭种子中携带的病原菌[19]。因此，利用抗病或耐病品种是控制牧草病害最经济、最安全、最有效的措施，有时，甚至是控制病害的唯一有效措施[64-66]。在美国、加拿大等国家，已对苜蓿抗黄萎病的机理有较深了解[66-69]，也挖掘出了多个苜蓿抗黄萎病菌的基因[50,69-72]，且选育出Barrier、AC Blue J、Pioneer5444等多个抗黄萎病的苜蓿品种，平均产量比感病品种高15%～20%(图4)，发病率仅为感病品种的20%～40%(图5)[19,43,67,73-75]。在疫区较其他品种而言，使用高抗品种使每公顷苜蓿地年平均收益提高21～44 USD[49]。

图4 田间自然侵染的苜蓿黄萎病对12个苜蓿品种产量的影响Figure 4 Effects of verticillium wilt on forage yield of 12 alfalfa cultivars in a field naturally infested with Verticillium albo-atrum

而我国育成的苜蓿品种多为感病品种[58,76]，目前尚无专门抗黄萎病菌的品种，一旦苜蓿黄萎病由国外疫区传入，现有品种的抗病性远不足以遏制该病害的传播蔓延。为及时有效地应对外来入侵生物可能造成的巨大灾害，必须依赖精准检测技术的研发和综合防治技术的研究。

5 苜蓿黄萎病在我国的发生状况

5.1 内忧重重

苜蓿黄萎病最早于1996年发现于新疆阿克苏地区温宿县托乎拉乡[22]。2003-2005年，又相继在巴州、伊犁州、阿勒泰地区发现39个疫情发生点，分布于4地(州)9个县(市)35个乡镇的37个村的苜蓿植株上，阿克苏地区温宿县托乎拉乡苜蓿被侵染后植株死亡率为35%～70%[28,48]。此后再无发生的报道，实地调查时也未发现病株。而且，由于该病害在新疆报道时仅采用形态学方法鉴定，未通过分子生物学手段检测基因，故其是否为苜蓿轮枝菌尚不得而知。

XU等[77]2014年在甘肃张掖地区发现的疑似苜蓿黄萎病菌，经形态学和分子生物学鉴定，证明为2014年Inderbitzin描述的苜蓿轮枝菌(V.alfalfae)，发表于Plant Disease期刊上。此前国际上公布发现此菌的国家有美国、加拿大和日本[19,21]，故我国为发现此菌的第4个国家。

世界主要病区都采用以选育和使用抗病品种为主的综合防治策略，而我国初步评价的部分苜蓿品种，对苜蓿黄萎病多为感病品种[20,27,58]。因此我国缺少抗病品种，一旦苜蓿黄萎病由国外疫区传入，现有品种的抗病性远不足以遏制该病害的传播蔓延。邵刚等[78]通过模拟研究寄主植物、温度、pH等数据，针对苜蓿黄萎病在我国的适生性分析，结果表明，从气候条件分析，该病害在我国的适生范围广、适生程度高、定殖风险大。每年4～9月份，该病在我国西北、东北以及华北地区的适生程度处于较高水平。我国许多苜蓿种植区的气候条件与欧洲、北美洲种植区极其相似，这就预示着苜蓿黄萎病一旦传入就可能有扩展蔓延的危险[27]，将对我国的生态保护、国民经济、尤其是畜牧业生产造成严重打击。

5.2 外患不断

随着国际贸易的不断发展，国外植物及其产品在对国内农业生产造成了强烈冲击的同时，附带复杂危险性病虫害的进境植物、植物产品及携带物数量大增，有害生物来源国家和地区不断扩大，植物检疫性有害生物随进口植物、植物产品及旅客携带物扩散传播的隐患也日益加大，防范外来有害生物传入的形势较为严峻[79]。苜蓿黄萎病传播途径较多，种子带菌是黄萎病远距离传播、特别是传入无病地区的主要途径。干草等草产品中植物病残体也可实现远距离传播。随着畜牧业的发展，我国苜蓿干草和苜蓿种子进口数量逐年激增，其中大约80%来自于北美。2002年7月，新疆检验检疫局自加拿大进口的80 t普通紫花苜蓿种子中，首次截获国家一类危险性病害苜蓿黄萎病菌，国家质检总局据此发布《关于苜蓿黄萎病的风险预警通报》，要求各地检验检疫局切实加强对来自疫区国家的苜蓿种子等货物的检验检疫[80]。随后，2010年1月，江苏出入境检验检疫局从一批重197 t进境美国的苜蓿草样品中截获了苜蓿黄萎病菌[60]；2010年10月，广西防城港检验检疫局截获了一批重118.6 t美国进口的苜蓿草[61]；2011年1月辽宁省检验检疫局从美国进口的2批次重达215 t苜蓿草产品中，检出苜蓿黄萎病菌。北美地区是苜蓿黄萎病的主要病原疫区，大量进口苜蓿的结果就是引入新病害，让我国本不够强大的牧草产业雪上加霜。

6 问题与展望

倘若1998年在新疆发生的是由苜蓿轮枝孢(V.alfalfae)引致的苜蓿黄萎病，而非大丽轮枝孢或黑白轮枝孢(除去苜蓿轮枝孢后的菌种)等其他轮枝孢引致的黄萎病，则该病害经过多年后彻底消失的原因是否如同美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)(1994年传入我国，曾一度扩展至全国各地，约8年后消失)等其他外来入侵生物一样，因不能适应而消失；抑或是在强大的防治、扑灭措施下被动消亡，不得而知。而甘肃张掖地区的自然条件与新疆阿克苏地区不同，该病害是否会逐渐消亡，还是会继续扩展蔓延，仍需严阵以待，制定切实有效的应对措施。

目前国内针对苜蓿黄萎病的研究非常有限，多集中在环境模拟、病原物生理生化、检测方法等几方面，而针对紫花苜蓿黄萎病的侵染循环和发生规律的研究均来自国外或我国学者在国外开展的研究。我国的土壤、气候和苜蓿栽培模式与国外存在一定差异，该病害传入我国后其发生和危害与国外有无差异尚不明晰，即作为一种外来入侵生物，其能否适应并在我国生存及扩张蔓延，是否对我国的苜蓿产业造成重大影响，均有待深入研究。

为此，应尽快开展苜蓿黄萎病发生规律的研究及该病害在我国的风险性评价，也就是针对病害的发生范围、严重程度、传播方式、侵染循环、检测技术、抗病育种等多方面开展系统性调查与研究，在此基础上，研发行之有效的防治措施。通过研究，如果该病害已经对我国苜蓿带来巨大损失，在当地也可长期生存并且存在有效越冬场所与传播途径，则说明其对我国苜蓿产业将带来巨大风险，必需尽早开展综合防治。