外源CaCl2缓解NaCl胁迫下酸枣幼苗叶和根转录组测序分析

王振东，鲁晓燕，涂文文，王晓丽,何晨晨

(石河子大学农学院/特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室, 新疆石河子832000)

0 引 言

【研究意义】土壤盐碱化是干旱和半干旱地区农业的主要威胁，土壤盐浓度的增加抑制了植物的生长，降低了吸收水分和养分的能力，破坏代谢过程和降低光合效率来影响生长[1-3]。钙是植物生长、发育必需的营养元素之一，植物生长发育的各个方面和应激生理是由Ca2+的化学信号介导的，在植物的生理过程中起着重要作用[4]；在盐胁迫下，补充适量的外源Ca2+可以提高植物对盐度的抵抗力[5]。酸枣(ZiziphusacidojujubaC.Y.Cheng et M.J.Liu)属鼠李科 (Rhammaceae) 枣属 (Ziziphus Mill.)，是我国的特色优势野生果树和重要的药用植物[6,7]；酸枣还是枣树最常用的砧木，具有抗旱耐瘠和耐盐碱的特点[8]。转录组学关注RNA水平的基因表达，并提供全基因组的基因结构和功能信息，以揭示参与特定生物过程的分子机制[9]。高通量测序技术可以高效的产生大量的短测序读数，同时对整个样本内容进行测序[10]。通过对两种处理下酸枣幼苗进行转录组测序分析，进一步完善了酸枣的基因信息，从转录水平上探究CaCl2缓解NaCl胁迫的机制。【前人研究进展】杨怡帆等[11]发现外源CaCl2可以提高酸枣各个器官自由水/束缚水、抗氧化物酶，降低细胞膜透性、MDA含量。吕新民等[12]证实外源CaCl2可以在盐胁迫下增强酸枣幼苗AsA-GsH能力，清除器官中过量H2O2的能力大大增强，以此缓解NaCl造成的损害。王晓丽等[13]发现外源CaCl2可通过促进酸枣幼苗根和茎内 GS/GOGAT 循环和提高幼苗氮素同化效率，从而提高了酸枣幼苗对盐害的适应性。前人大量的研究主要在抗氧化物保护酶、AsA-GSH循环、氮代谢等生理特性方面，而利用分子生物学手段来研究酸枣盐胁迫下的转录调控鲜有报道。【本研究切入点】第二代高通量测序技术可以快速和准确的对整个样本内容进行测序，利用高通量测序技术对处理后的酸枣幼苗叶片和根系进行了转录组测序和生物信息学分析。【拟解决的关键问题】利用转录组测序技术对NaCl和NaCl+CaCl2处理6 h的酸枣幼苗叶片和根系进行测序，筛选外源CaCl2缓解NaCl胁迫下酸枣幼苗叶和根的差异表达的基因，并通过GO和 KEGG 通路分析差异基因的分子功能和代谢途径，为进一步研究CaCl2缓解酸枣盐害基因功能提供了重要参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

挑选均匀一致的酸枣种子，用0.5% KMnO4浸泡消毒30 min后放入发芽盒，置于人工气候箱(RXZ智能型，宁波江南仪器厂)中催芽，待幼苗长出2片真叶后，选择生长健壮、整齐一致的幼苗悬浮于2 cm厚的泡沫板水培盒中置于人工气候箱(光照强度12 000 lx，光照时间14 h，黑暗时间10 h；相对湿度65%～70%；温度25～28℃)。水培盒大小为19 cm×13 cm×11 cm(长×宽×高)。每个水培盒加1倍日本园试配方营养液500 mL，每3 d更换一次营养液。

幼苗长到6片真叶完全展开时，开始处理：(1)Na处理(CK)：日本园试配方营养液+150 mmol/L NaCl(2)Na+Ca处理：日本园试配方营养液+150 mmol/L NaCl+10 mmol/L CaCl2；每个处理重复3次，每个重复15株幼苗。为避免盐激反应，Na处理和Na+ Ca处理中，NaCl浓度以每天50 mmol/L的梯度逐步递增，全部处理于同一天达到目标浓度，此时设为第0 h，在处理时间6 h时进行采样，酸枣叶片在150 mmol/L NaCl处理样本记为L Na，酸枣叶片在150 mmol/L NaCl +10 mmol/L CaCl2处理样本记为L NaCa，酸枣根系在150 mmol/L NaCl处理样本记为R Na，酸枣根系在150 mmol/L NaCl +10 mmol/L CaCl2处理样本记为R NaCa。随机取每个处理中酸枣幼苗的根系、叶片。每个器官设置3个重复，取样后立即放入液氮中，放入超低温冰箱(-80℃)中保存。用于RNA提取和转录组测序。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取，文库构建及测序

酸枣幼苗叶和根的后续处理包括总RNA提取、纯化、质量分析和文库构建，转录组测序委托深圳华大基因有限公司进行。酸枣幼苗叶和根总RNA提取后利用Agilent 2100和Fragment Analyzer检测其RNA样品的纯度、浓度和完整性。用带有OligdT的磁珠富集mRNA，将得到的mRNA反转录合成cDNA，对其进行末端修复、加A 尾并连接测序接头，连接产物通过特异的引物进行PCR扩增后将单链DNA环化得到单链环状DNA文库，最后用BGISEQ-500测序平台进行测序。

1.2.2 数据拼接与组装

测序所得的原始数据(raw reads)用过滤软件SOAPnuke进行过滤，过滤掉低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads，获得clean reads，并对其进行拼接。将拼接得到的转录本序列，作为后续分析的参考序列。

1.2.3 基因差异的筛选与注释

使用DEGSeq[14]对4个样品之间差异表达量分析，每个基因的P值用Qvalue进行多重假设检验校正，为了提高DEGs的准确性，定义差异倍数为两倍以上并且Q-value ≤ 0.005的基因，筛选为显著差异表达基因。

将差异表达的基因进行富集分析，主要包括GO(Gene Ontology)注释和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)代谢通路分析。根据GO注释和KEGG 注释结果以及官方分类，将差异基因进行分类，同时使用R软件中的phyper函数进行富集分析，计算P-value，然后对P-value进行FDR校正，通常FDR≤0.01的功能视为显著富集。

2 结果与分析

2.1 测序数据质量

研究表明，通过转录组测序，酸枣叶片在Na和Na+Ca处理后分别产生73 420 610、72 660 059条原始数据，酸枣根系在Na和Na+Ca处理后分别产生72 586 640、70 139 213条原始数据。在去掉含低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的reads后，酸枣叶片在Na和Na+Ca处理后分别获得70 354 474、68 689 952干净的高质量序列；酸枣根中Na和Na+Ca处理下分别获得了69 240 438、67 274 418干净的高质量序列，且Q20都达到97%以上和Q30都达到88%以上，不确定碱基比例均小于0.4%，说明转录组测序质量较好。表1

表1 测序产出数据质量评估
Table 1 Assessment of the quality of sequencing output data

样品名SampleL_NaL_NaCaR_NaR_NaCa原始数据Raw Reads 73 420 61072 660 05972 586 64070 139 213过滤后的数据Total Clean Reads 70 354 47468 689 95269 240 43867 274 418Q20(%)97.7797.3697.7797.76Q30(%)89.988.9889.7989.96N(%)0.280.330.220.28

2.2 酸枣幼苗在Na和Na+Ca处理后差异基因

研究表明，与Na处理相比，Na+Ca处理6 h时，酸枣幼苗叶片存在8 612个差异表达基因，其中7 365个DEGs在盐胁迫响应中上调表达，1 247个DEGs表达下调；酸枣幼苗根系存在5 623个差异表达基因，其中 762个DEGs表达上调，4 861个DEGs表达下调。 图1

图1 CaCl2处理对NaCl胁迫下酸枣幼苗差异基因数量统计
Fig.1 Number Statistics of Differential Genes in Jujube Seedlings under NaCl Stress Treated with CaCl2

2.3 差异表达基因的 GO 功能注释

GO分类分为分子功能、细胞组分和生物过程三大功能类，根据差异基因检测结果进行功能分类。Na+Ca处理与Na处理相比，酸枣叶片富集了43个GO条件(15 127条)，包括了18个生物过程(5 213条)，14个细胞成分(5 299条)，11个分子功能(4 615条)被富集；根系中富集了42个GO条件(8 847条)，包括了17个生物过程(3 053条)，14个细胞成分(3 071条)，11个分子功能(2 723条)被富集。图 2

图2 NaCl处理与NaCl+CaCl2处理间差异基因的的Go功能注释分类统计
Fig.2 Classification Chart of Go Functional Annotation of Differential Genes between NaCl Treatment and NaCl+CaCl2Treatment

2.4 差异表达基因的 GO 富集

将GO注释中差异基因进行显著富集，酸枣幼苗叶片中富集到最多的10个GO条目是催化活性(GO:0003824)、细胞膜(GO:0016020)、膜部件(GO:0044425)、膜的固有成分(GO:0031224)、膜的组成部分(GO:0016021)、阳离子结合(GO:0043169)、金属离子结合(GO:0046872)、氧化还原酶活性(GO:0016491)、定位(GO:0051179)、建立定位(GO:0051234)；其中催化活性(GO:0003824)表达注释量最多有878个差异基因富集到，有785个上调，93个下调。

酸枣幼苗根系中富集到最多的10个GO条目是催化活性(GO:0003824)、细胞膜(GO:0016020)、膜部件(GO:0044425)、膜的固有成分(GO:0031224)、膜的组成部分(GO:0016021)、阳离子结合(GO:0043169)、金属离子结合(GO:0046872)、氧化还原酶活性(GO:0016491)、氧化还原过程(GO:0055114)、金属离子转变(GO:0046914)；催化活性(GO:0003824)表达注释量最多有1 311个差异基因富集到，有237个上调，1 074个下调。

对两种处理下酸枣叶片和根系转录组Unigene进行GO富集，发现酸枣幼苗叶片和根系关于细胞膜相关被富集到差异基因最多，这说明细胞组分中的细胞膜在酸枣幼苗适应盐胁迫和CaCl2的缓解盐胁迫作用中发挥着重要作用。酸枣幼苗叶片GO富集表现出下调基因多于下调基因，而根系表现出下调基因多于上调基因，叶片和根系表现出相反的结果。表3,表4

表 3 酸枣叶片在NaCl处理与NaCl+CaCl2处理间差异基因富集最多的前10条GO注释
Table 3 The top 10 GO annotations with the highest concentration of differentially expressed genes between NaCl and NaCl+CaCl2treatments in jujube leaves

GO Term IDGO注释GO annotation GO注释中显著DEGs Significant DEGs in GO Annotations上调Up下调DownGO:0003824催化活性87878593GO:0016020膜62154774GO:0044425膜部件45840157GO:0031224膜的固有成分45039456GO:0016021膜的组成部分44739156GO:0043169阳离子结合30227824GO:0046872金属离子结合28926524GO:0016491氧化还原酶活性22620917GO:0051179定位15113318GO:0051234建立定位15013218

表 4 酸枣根系在NaCl处理与NaCl+CaCl2处理间差异基因富集最多的前10条GO注释
Table 4 The top 10 GO annotations with the highest concentration of differentially expressed genes between NaCl and NaCl+CaCl2treatments in jujube root system

GO Term ID分子功能中的GO注释GO annotation in molecular function GO注释中显著DEGs Significant DEGs in GO Annotations上调Up下调DownGO:0003824催化活性1 3112371 074GO:0016020膜926160766GO:0044425膜部件662107555GO:0031224膜的固有成分649105544GO:0016021膜的组成部分646105541GO:0043169阳离子结合41582333GO:0046872金属离子结合40282320GO:0016491氧化还原酶活性34069271GO:0055114氧化还原过程23757180GO:0046914金属离子转变23046184

2.5 差异基因的KEGG代谢途径

根据 KEGG 注释结果以及官方分类，将差异基因进行生物通路分类。酸枣叶片中7 521条Unigene能够被KEGG 数据库成功注释，根中有5 041条Unigene能够被KEGG 数据库成功注释，它们涉及到代谢(氨基酸代谢、其他次生代谢产物的生物合成 、碳水化合物代谢 、能量代谢、 全球和概述图 、聚糖生物合成与代谢 脂代谢、辅助因子和维生素的代谢 、其他氨基酸的代谢 、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢 、核苷酸代谢)、细胞过程(运输和分解代谢)、有机系统(环境适应)、环境信息处理(膜运输 、信号转导)、遗传信息处理(折叠、分类和降解、复制和修复、转录、翻译)5个大类、19中类。图3

图3 NaCl处理与NaCl+CaCl2处理间差异基因的KEGG分类统计
Fig.3 KEGG taxonomic map of differentially expressed genes between NaCl treatment and NaCl+CaCl2treatment

2.6 差异表达基因的KEGG富集

对KEGG中所有的代谢通路均使用R 软件中的phyper函数进行富集分析，筛选出DEGs显著性富集最多的前10条代谢通路，叶中分别是：植物病原互作(473)、MAPK信号通路-植物(296)、植物激素信号转导(270)、苯丙醇生物合成(260)、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化(164)、核糖核酸聚合酶(139)、ABC转运器(133)、氰氨基酸代谢(108)、倍半萜和三萜生物合成(66)、二萜生物合成(62)，根中分别是：植物病原互作(274)、苯丙醇生物合成(193)、嘧啶代谢(124)、核糖核酸聚合酶(107)、ABC转运器(100)、氰氨基酸代谢(89)、二萜生物合成(48)、泛醌和其它萜类醌生物合成(48)、苯丙氨酸代谢(46)、倍半萜和三萜生物合成(44)。

酸枣叶片和根系转录组Unigene进行KEGG富集,发现植物病原互作、MAPK信号通路-植物、植物激素信号转导等代谢途径和信号转导在酸枣生理活动中占有重要作用，所涉及到的Unigene数量也较多。两种试验处理下酸枣幼苗根系相比于叶片富集KEGG注释到显著性通路少且发生差异基因也少。依据差异表达基因在KEGG 分析中不同代谢和信号通路，为研究酸枣幼苗外源CaCl2缓解盐胁迫的过程、生物功能以及代谢途径提供了有效依据，可以直观的了解酸枣幼苗在CaCl2缓解下代谢过程和信号转导途径的变化情况。表5

表5 酸枣叶片和根系在NaCl处理与NaCl+CaCl2处理间差异基因富集最多的前10条KEGG通路
Table 5 The top 10 KEGG pathways with the highest concentration of differentially expressed genes between NaCl treatment and NaCl+CaCl2treatment in the leaves and roots of jujube

叶片根系代谢通路IDPathway ID代谢通路注释Pathway Name注释到该通路的差异基因数DEGs in the pathway with annotation 代谢通路IDPathway ID代谢通路注释Pathway Name注释到该通路的差异基因数DEGs in the pathway with annotation ko04626植物-病原互作473ko04626植物-病原互作274ko04016MAPK信号通路-植物296ko00940苯丙醇生物合成193ko04626植物-病原互作274ko00240嘧啶代谢124ko04075植物激素信号转导270ko03020核糖核酸聚合酶107ko00940苯丙醇生物合成260ko02010ABC转运器100ko00940苯丙醇生物合成193ko00460氰氨基酸代谢89ko00040戊糖和葡萄糖醛酸相互转化164ko00904二萜生物合成48ko03020核糖核酸聚合酶139ko00130泛醌和其他萜类醌生物合成48ko02010ABC 转运器133ko00360苯丙氨酸代谢46ko00240嘧啶代谢124ko00909倍半萜和三萜生物合成44

3 讨 论

新一代高通量测序技术—转录组测序(RNA-Seq)技术，能够高效全面的获得研究样本转录本，进而反映出研究样本的表达水平[15,16]。随着转录组测序技术的发展和在应用，果树抗逆分子生物生物学研究也快速发展，特别是盐胁迫下果树逆境调控也取得飞速发展[17]。采用高通量测序技术已经对盐胁迫下巴西蕉[18]、葡萄[19]、梨[20]等果树进行转录组测序，并发现了大量与耐盐相关的基因。试验在NaCl处理与NaCl+CaCl2下对酸枣幼苗叶片和根系进行了转录组测序，发现酸枣幼苗叶片中7 365个上调表达，1 247个下调表达；根系中762个上调表达，4 861个下调表达；在这两种处理下酸枣幼苗叶片中上调基因数多于下调，根中下调基因数多于上调，可见CaCl2缓解酸枣幼苗盐胁迫根系和叶片作用机制有所不同。

第二信使Ca2+广泛的参与植物对许多信号的转导，植物对许多外界环境和激素等刺激作出的反应是通过胞质中自由Ca2+浓度变化来传递的[21,22]。在响应逆境胁迫时，Ca2+下游的激酶比如钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs)、钙调素(Calmodulin, CaM)和类钙调素蛋白(Calmodulin-like proteins, CMLs)等酶会被激活[22]。研究中发现实验中NaCl胁迫下，添加外源CaCl2后发现酸枣叶片中CDPKs基因16个上调，2个下调，CMLs基因有14个上调，3个下调，CaM基因有11个上调，2个下调；根系中CDPKs基因1个上调，8个下调，CMLs基因有5个上调，4个下调，CaM基因有1个上调，6个下调。酸枣叶片在处理后均出现上调，而根系大多出现下调。另外，SOS(salt overly sensitive)途径是植物在盐胁迫条件下Na+/K+调节的主要信号途径，并在维持细胞内离子平衡起着重要作用[23]。由盐胁迫引起细胞内Ca2+浓度的增加被SOS3 感应，SOS3与Ca2+结合并激活SOS2，通过相互作用形成 SOS2/SOS3 复合物，SOS2/SOS3 复合物将SOS2运输至质膜从而激活SOS1的活性，将Na+排出细胞，从而减少Na+的积累，维持细胞的离子平衡[24-26]。研究在酸枣幼苗叶片中发现2个上调表达的SOS2相关基因，根中发现1个下调表达的SOS2相关基因，推测盐胁迫下酸枣幼苗中存在SOS信号传导途径可能参与CaCl2缓解盐胁迫响应。

在植物对逆境胁迫的应答反应中转录调控具有重要的作用，植物感受外界环境条件发生变化时，通过一系列传递激发转录因子从而启动基因的转录表达，调控并减轻逆境胁迫对植物的伤害[27]。在植物体中和逆境抗性相关的主要有4 类：AP2/EREBP、MYB、WRKY、和bZIP/HD-ZIP[28]，其中MYB转录因子是其中功能最丰富、数量最多的转录因子家族之一[29,30]。有大量的研究指出MYB基因能调节盐胁迫下ABA生物合成和信号传导来调节植物盐胁迫耐受[31,32]。通过高通量测序研究发现甜瓜[33]、花生[34]等植物在盐胁迫下MYB转录因子的基因表达量发生了明显变化，这些都证明MYB转录因子参与了植物对盐胁迫的响应。在试验中发现酸枣幼苗NaCl胁迫下，添加外源CaCl2后有MYB转录因子参与了响应，在叶中有个23个MYB 基因上调表达，3个下调表达；根中有6个MYB 基因上调表达，28个下调表达。这些转录因子的表达量发生变化，MYB转录因子参与CaCl2缓解盐胁迫应答，并在酸枣盐胁迫响应中起到重要的作用。

4 结 论

研究对NaCl处理和NaCl+CaCl2处理的酸枣幼苗叶片和根系进行了转录组分析，利用高通量测序技术获得了酸枣转录组的大部分信息，比较了两种处理后的差异表达基因，发现酸枣幼苗叶片和根系上调基因分别为7 365和762个，下调基因的分别有1 247和4 861个。GO富集分析中，差异基因主要在催化活性、膜、膜部件、膜固有成分、膜的组成部分等；KEGG分析表明，差异基因主要在涉及植物病原互作、MAPK信号通路-植物、植物激素信号转导、苯丙醇生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化等。