广东口岸结核分枝杆菌生物样本库的建设

吴 健，张建明，温 颖，雷 达，吴培丰，高颖龙，王向阳，何洪涛

结核依然是严重威胁人类健康的传染病，据世界卫生组织数据显示[1]，2017年全球结核病新发病例1 000万，结核病死亡病例130万，耐利福平及耐多药结核病例55.8万；中国新发结核病例88.9万，耐利福平及耐多药结核病例7.3万，死亡结核病例3.9万,是全球耐多药结核最为严重的国家之一。到目前为止，人类依然面临着结核预防控制、临床诊疗中的诸多瓶颈问题，建设高质量、高标准的菌种生物样本库是结核基础和临床研究的基石，对于传染源追踪，结核传播规律、结核耐药机制研究，诊断试剂研发，新型治疗药物及疫苗的研制等研究领域都具有重要意义，最终有助于人类实现消灭结核的终极目标[2]。

广州国际旅行卫生保健中心实验室为中华人民共和国广州海关所属结核病检测重点实验室，承担广东口岸出入境人员结核病疑似患者的实验室检测任务，已在出入境人员中累计分离培养结核分枝杆菌近千株，来源于国内及20余个国家和地区的出入境人员，菌种生物学资源丰富。现将实验室结核分枝杆菌生物样本库的建设情况总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本管理软件 FreezerPro生物样本库管理软件。

1.1.2 仪器设备 BACTECTMMGITTM960分枝杆菌培养系统(美国BD公司)，Baker生物安全柜，Thermo 991超低温冰箱，超声振荡仪，高速离心机，HIRAYAMA高压灭菌器，BRADY BP IP300耐低温条码打印机，移液器。

1.1.3 耗材 冻存盒、冻存管、冻存架、耐低温条码、灭菌移液吸头、15 mL无菌离心管，5 mL离心管。

1.1.4 试剂 罗氏培养基，广东省结核病控制中心提供；分枝杆菌生长培养管(mycobacteriagrowth indicator tube,MGIT)，美国Bection Dickinson公司提供；结核分枝杆菌检测试剂盒(AccuProbe M.Tuberculosis Complex)，美国Gene-Probe公司提供；血平板，广州环凯生物科技有限公司提供；菌种保存液[3]7H9保存液(0.47% 7H9粉剂、20%甘油、10%抗生素混合液)，配制后经121 ℃，30 min高压蒸汽灭菌，冷却后分装至冻存管中4 ℃冰箱保存备用。7H9粉剂及抗生素混合液，美国Bection Dickinson公司提供。

1.1.5 实验室生物安全等级 广东国际旅行卫生保健中心结核病检测实验室为加强型生物安全二级实验室[4]，已在当地卫生主管部门备案。结核分枝杆菌分离、培养、鉴定及菌种保存等实验活动均在加强型生物安全二级实验室内完成，所有实验操作在生物安全柜中进行，确保实验室生物安全。

1.2 方法

1.2.1 样本来源 广州口岸出入境人员中经胸部X线检查或结核感染T细胞检测等方法检出的结核疑似病例，留取连续3 d空腹晨痰分别进行检测，经鉴定为结核分枝杆菌的菌株纳入菌种库进行保存。

1.2.2 样本检测 痰标本经N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH充分消化处理，所获得沉渣分别进行集菌涂片及金胺O染色，接种罗氏培养基、MGIT培养管各1支置于恒温培养箱及BACTECTMMGITTM960中进行培养，对培养阳性样本进行涂片抗酸染色，抗酸染色阳性者经基因探针核酸杂交法进行菌种鉴定，鉴定为结核分枝杆菌复合群者采用BACTECTMMGITTM960系统液体比例法进行一线和(或)二线抗结核药物敏感性实验。

1.2.3 样本信息采集

1.2.3.1 样本基础信息 包括病例的性别、年龄、职业、文化程度、来源地区、人员类别、旅行史、相关病史、分离时间、临床症状、临床治疗记录以及常规血液生化等检测指标，录入样本管理系统，所有病例的相关信息收集整理均在收集前获得知情同意。

1.2.3.2 样本生物学信息 包括痰涂片抗酸/金胺O染色结果、菌落形态、一线(链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺)及二线(阿米卡星、卷曲霉素、乙硫异烟胺、KAN卡拉霉素、氧氟沙星、对氨基水杨酸)抗结核药物药敏结果、利福平耐药基因rpoB常见耐药突变、异烟肼耐药基因katG、inhA常见耐药突变、MIRU基因分型、Spoligotyping分型等。

1.2.4 样本制备

1.2.4.1 菌种制备 ①从4 ℃冰箱中取出适当数量的菌种保存管(每株菌分别保存3～4支)，室温平衡，打印二维码粘贴备用。②取经鉴定的结核分枝杆菌菌种重新转种至新的MGIT培养管中培养至报告阳性，肉眼观察培养基背景澄清，结核杆菌呈颗粒状分布，即可进行菌种保存。③取MGIT培养管置于涡旋震荡仪震荡30～60 s，3 000 r/min离心5 min，弃上清，剩余约1 mL菌悬液充分混匀后平均分装至准备好的菌种保存液中。④制备好的菌种保存管扫描二维码录入样本管理系统，放入-80℃冰箱指定位置长期保存[3]。

1.2.4.2 DNA制备 混匀MGIT培养管中的菌液，吸取1 mL于1.5 mL离心管中，13 000 r/min离心15 min，弃上清，加入100 μL分子生物级灭菌水重悬；上述制备好的菌液置于95 ℃水浴中灭活20 min，移入超声振荡仪中作用15 min后，15 000 r/min离心5 min，吸出上清液，即为所提取的DNA，每支20 μL分装至3～5支0.5 mL离心管中保存。

1.2.5 样本的标识与储存

1.2.5.1 样本编号标识 登录FreezerPro生物样本库管理软件，通过样本号自动生成样本标识条码。

1.2.5.2 样本储存 样本储存按样本种类、分离时间等分区储存于-80 ℃超低温冰箱中，冰箱温度实时监控。

1.2.6 质量控制

1.2.6.1 菌种纯度检测 在FreezerPro软件中将待抽检菌种出库，从冰箱中取出目标菌种，置37 ℃水浴中快速解冻后充分混匀，将菌液用接种环无菌接种于血平板，37 ℃恒温培养箱培养，血平板连续培养72 h观察有无杂菌生长。

1.2.6.2 菌种活力检测 移液器吸取100 μL上述菌悬液接种于中性罗氏培养基，置37 ℃恒温培养箱中孵育培养，定期观察罗氏培养基，记录出现肉眼可见菌落的时间及菌落形态。

1.2.6.3 菌种特性检测 取1.2.6.2所培养的菌落，进行药敏试验或耐药基因突变检测，与既往检测结果进行比对，是否保持原有特性。

1.2.6.4 DNA质量检测 通过核酸蛋白分析仪检测所保存DNA的浓度。

1.2.6.5 质控频次 菌种抽检均以5%的比例按照随机抽样的方式每年抽取前一年保存的菌种进行纯度、活力及特性的检测；DNA抽检以5%的比例按照随机抽样的方法每年抽取前一年保存的DNA样本进行检测。

1.2.7 菌种库管理 样本管理软件由专人进行设置维护，定期升级更新；样本入库后由专人进行相关资料收集整理，并导入系统；样本出库需经负责人审批，样本出库后从使用到废弃全过程需详细记录，确保每份样本流向清晰，保持管理系统数据与实物库一致；样本库保管采用双人双锁，确保样本安全；样本储存超低温冰箱温度进行时实监控，确保样本质量。

2 结果

2.1 标识及保存

2.1.1 菌种及DNA标识 样本标识采用四级编号，包括超低温冰箱、冻存架、冻存盒及冻存盒内位置等相关信息，对应生成每株菌的唯一性二维码标识及唯一样本编号(图1)，菌种与其DNA的编号相对应，多管相同的样本通过分管号进行区分。通过二维码可追溯样本的所有信息资源。所采用条码标签为专用耐低温条码，耐酸碱、防水、防油污且粘贴牢固不脱落。

图1 样本二维码及编号

2.1.2 保存位置 菌种与DNA分开存放于-80 ℃冰箱不同储存室中；按分离时间不同分列于不同冻存架中，每个冻存架包含若干冻存盒，样本则按编号顺序存放于相应冻存盒中。

2.2 菌种库构成 截至2017年12月，结核分枝杆菌菌种库库存结核分枝杆菌863株，每株菌含保存菌种3～4支，每支800 μL，含保存DNA 3～5支，每支20 μL。菌种库菌种来源构成及菌种生物学特性分别见表1，表2。

2.3 菌种库质量抽检 通过对菌种库库存菌种进行抽检，总体菌种保存状态良好，生物学特性稳定，对2株检出的杂菌污染菌及非结核分枝杆菌混杂菌进行了剔除、废弃。

表1 菌种库菌种构成(n=863)

表2 菌种库菌种生物学特性(n=863)

3 讨论

我国生物样本库的收集最早开始于20世纪70年代，但早期的样本收集存在无序、分散、封闭、缺乏标准化流程、缺乏质控体系与信息化管理、临床资料残缺不全(尤其是治疗与随访资料)、伦理学与相关法律不健全等问题,导致其所能发挥的作用非常有限[5]。进入21世纪以来，国内生物样本库建设逐渐步入正轨，凭借着人口基数大、病例资源丰富等优势，逐步建成一批有代表性的生物样本库，包括中山大学肿瘤防治中心肿瘤资源库、天津协和干细胞库、北京市乙型病毒性肝炎/艾滋病样本库等[5]。同时，生物样本库建立与运行的技术标准体系也在逐步形成，2011年，由中国医药生物技术协会发布了《生物样本库行业标准》[6]，并推行生物样本库的质量监督检查，促进了数据的可靠性、提高了样本的使用率，不断推动了基础医学、转化医学的发展[7]。

菌种库作为生物样本库的一个重要部分，对于研究病原体的分子流行病学特征、遗传及变异规律、疾病爆发的传染源追溯、耐药突变机制研究、诊断试剂及疫苗研发等具有重要意义，但国内有关结核分枝杆菌菌种库的文献报道并不多见，刘志辉等[8-9]、柳正卫和丁北川[10]在分枝杆菌菌种库的系统建设方面进行了有意义的探讨，但国内分枝杆菌菌株库建设依然存在菌株收集盲目、菌株资料局限和保存方法单一等问题[11]。

国外文献报道主要有2个结核分枝杆菌菌种库，分别是：①TDR-TB结核分枝杆菌菌种库(TDR-TB Strain Bank)，由世界范围内多家实验室共同创立，报道库存耐药结核菌种229株，来源于世界范围内31个国家和地区，主要应用于结核杆菌耐药机制研究、结核及耐药结核诊断试剂研发及跨国结核参比实验室能力验证项目[12]。②FIND结核分枝杆菌菌种库(FIND Tuberculosis Strain Bank)，由FIND基金会创建，主要收集耐药结核菌株(包括单一耐药、耐多药、广泛耐药)，所有库存菌种包含完整的感染者信息及菌种的生物学信息，主要应用于耐药结核耐药机制及新的诊断技术方法研究[13]。

本实验室主要承担广东口岸出入境人员结核病疑似患者的实验室检测工作，病例来源包括全国各地的出境人员及来自非洲、东南亚等近20余个国家和地区的入境人员，病例地域分布广泛，所感染结核分枝杆菌菌种生物学资源丰富，相比国内的菌种库有其独特之处。鉴于日常科研工作中所遭遇的样本流行病学资料、临床资料不全，样本生物信息资料缺乏，使研究无法深入的窘况，吴玲等[14]在对广州市胸科医院库存的广州地区15 854株分枝杆菌菌种的资源组成进行了系统的分析后，也报道约1/4保藏菌株的患者信息资料不完整。因此，我们着力将菌种库的菌种资源信息建设作为工作的首要任务，收集整理详细的宿主流行病学资料、临床资料及菌种生物学特征信息资料，利用实验室生物样本智能管理系统(RuRo FreezerPro)对样本资料信息进行系统的分类管理，使信息数据的录入、查询及管理高效而便捷。但比较而言，国外菌种库[12-13]包含了更为详尽的菌种生物学特征信息：包括rpoB、katGinhA、embB、rpsL、rrs、gyrA等耐药基因序列分析，基因分型甚至全基因组序列等，给菌种库未来的使用带来了极大的便利，也节省了重复检测的成本。

经过近十年的建设，本菌种库目前已累计保存结核分枝杆菌菌种863株，数量还在不断增加。除结核分枝杆菌临床分离株外，本菌种库还保存了标准结核分枝杆菌菌株：H37Ra(ATCC 25177)1株，参加世界卫生组织跨国结核实验室网络结核分枝杆菌药物敏感试验能力验证样本30株，参加中国疾病预防控制中心传染病预防控制中心结核病参比实验室抗结核药物敏感性试验熟练度测试项目样本120株。与TDR-TB菌种库和FIND菌种库所不同的是，这2个菌种库侧重于提供不同生物学特性的标准化菌株，关注菌种的纯度及长期研究的稳定性，因而所保存的菌种均来源同一个单一克隆，不一定能够反应其对应宿主体内结核种群的所有特征[12]，本菌种库所保存的是宿主体内完整的结核杆菌种群。

在菌种库的保存样本种类方面，本菌种库除保存分枝杆菌菌种外，还保存了菌种DNA样本，可直接用于核酸水平的研究工作，并保存了宿主部分血液检测结果，在菌种库的不断建设中还可尝试同时保存宿主的血液或者尿液样本。TDR-TB菌种库同时配套建立了TDR-TB样本库[15]，主要收集结核组及具有相同临床症候群的非结核组对照病例的痰液、尿液、血液等各类样本；FIND菌种库也保存了同时采集的患者痰液、血液、尿液或唾液样本[13]，这对于结核特定领域的深入研究具有重要意义。

本菌种库的使用主要用于实验室内部的科研工作，包括结核快速诊断试剂研究、耐药结核耐药突变基因筛查、结核杆菌全基因组测序等。菌种生物学信息的获得也是建立在菌种库的基础之上，所获得的结果又同时成为样本库资源的重要组成部分，两者相辅相成。TDR-TB库[12，15]免费为申请机构提供用于包括抗体检测、核酸检测、结核抗原靶标、蛋白质组学等研究领域的菌种，并已取得显著成果，包括进入临床应用的Xpert MTB/RIF，Cephid检测技术平台等，充分体现了菌种库的研究价值，实现了资源共享，其运作模式值得国内借鉴。

随着菌种保藏质量的不断提高，数量的不断增加，样本的资源信息不断丰富完善，将菌种库逐步建设成为样本管理系统化、规范化，样本种类多样化的结核分枝杆菌生物样本库，在满足自身科研工作的同时，还可将样本提供给出入境口岸、甚至结核病防控系统其他实验室开展相关科学研究，共同促进结核研究领域的不断进步。