多中心风湿免疫病生物样本库标准化建设与意义

曾惠琼，丁慧华，熊力群，唐元家，孙华麟，康晓楠，张 跃，叶志中

生物样本库是一种集中保存各种人类生物材料，用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统。基于收集高质量的结缔组织病组织及以血液、尿液为主的体液样本是发现风湿免疫病遗传生物标志物及药物作用新靶点的物质基础。生物样本资源的重要性已经得到充分的认识和广泛的重视[1-2]。2015年,美国宣布启动精准医学计划；2016年,我国科技部将精准医学纳入到“十三五”重大科技专项。精准医学的发展同样需要生物样本库，作为专项指南明确指出，开展健康队列、重大疾病、罕见病等研究，必须有生物样本库、数据库等平台作为课题研究支撑。为了整合深圳市人群病例资源，为临床与基础科学研究提供可靠的资源平台，深圳市福田区风湿病专科医院自2014年12月开始组建深圳市人群风湿免疫病生物样本库，并利用深圳市“三名工程”平台柔性引进上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科并与之合作，实现多中心、云共享管理模式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例选择 所有病例均来源于在我院门诊及住院风湿病患者，原则上，所有风湿免疫病均具备入库资格，但基于我院实际情况，我们重点采集系统性红斑狼疮(systemic lupus erethematosus,SLE)、骨性关节炎(Ostoarthritis,OA)、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、骨质疏松症、强直性脊柱炎、干燥综合症、系统性血管炎、未分化结缔组织病8个病种。所有患者诊断均符合各个病种诊断及治疗指南。所有入组患者均填写详细问卷，包括一般人口学、疾病、流行病学、家系等资料。

1.1.2 主要设备 4 ℃冰箱(579L，青岛海尔集团)，-80 ℃冰箱(DW-86L-286，青岛海尔集团)，台式离心机(600C，北京白洋医疗器械有限公司)，Real-time PCR扩增仪(ABI7300，美国Thermo Fisher公司)，紫外/可见光光度计(NanoDrop 2000，美国Thermo Fisher公司),电热恒温水箱(CU-420型，上海一恒科学仪器有限公司)，贝迪打印机(BP-IP300，美国BRADY公司),液氮罐(YDS-65-216，成都金凤液氮容器有限公司)、-20 ℃、-4 ℃冰箱(BCD-257SL，青岛海尔集团)、凝胶电泳分析系统(GDS-8000,英国UVP公司)。另设PCR室、分子生物室、血清室等用于提取核酸，分离淋巴细胞，进行PCR扩增等分子生物学相关研究。

1.2 方法

1.2.1 人员配置与建库流程 参照上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科生物样本库的建设模式[3]，参考生物样本库国际规范和指南标准化建设[4]。结合医院自身特点，我院生物样本库组织架构主要由以下部分组成:执行委员会、学术委员会、伦理委员会、质控小组等。在此基础上安排科研助理专员、质控专员分别负责样本的采集和前处理、核酸蛋白提取和质量管理、样本信息数据管理、样本出入库和常务管理等，并按照岗位职责的不同给予相应的培训内容、方式、要求和频率，定期参加生物样本库标准化建设会议。

1.2.2 伦理规范 收集生物样本库样本必须先征得患者的知情同意并签署知情同意书。同时经过我院伦理委员会审查，严格保护患者隐私和权益。

1.2.3 组织样本的采集和处理

1.2.3.1 血液样本的采集与保存 血清、血浆、全血(用于备提RNA，DNA和外周血单个核细胞等)。血液样本采集选用风湿病患者外周静脉采血，采集方案选择应遵循不同项目方案，成人捐献者采集量一般为10～15 mL，其中10 mL抗凝管，5 mL促凝管。血清样本使用标准真空负压采血管，常温直立静置30 min，待血液凝固析出血清，分管，标记，入库。全血采集至抗凝管充分颠倒混匀后，分装分离血浆和白细胞，标记，入库。血浆留取后分管，标记，入库，剩下部分用于分离粒细胞、外周血单个核细胞等，提取后标记，入库。核对样本标签编号后入库-80 ℃冰箱或液氮罐保存。

1.2.3.2 尿液样本的采集与保存 尿液采集相对简单，尿液是蛋白质、代谢物的主要来源之一。我们收集风湿病患者晨尿或随机尿液、24 h尿液。单次尿液采集量50 mL。根据研究目的和用途，可分为混匀尿、尿液上清和尿沉渣。采集后标记，入库，将冻存管装盒后根据系统分配位置冻存于-80 ℃冰箱中。

1.2.3.3 唾液样本的采集与保存 目前采用唾液采集管(Salivette)采集唾液后离心获得样本，常温保存，采集后的唾液根据标准操作规程进行直接分装或低速离心，产生的上清和沉淀分别单独保存。唾液样本建议500 μL/管分装。若需长期保存可进行冻存(-80 ℃保存)。该样本与尿液一样属于无创性操作，简单易行，目前国内罕见有生物样本库存储此类样本，开发用于唾液收集和基于SOPS标准对于建立一个新的唾液生物样本库至关重要[5-7]。

1.2.3.4 关节液样本的采集与保存 多种风湿病发病以关节滑膜增生为主要病理基础，患者常伴有关节肿胀，所以，采集关节液对关节局部炎症等病变分析有重要作用。通过门诊或住院医师无菌操作取得关节液，抽出液体后，要记录液体数量，样本库留取样本分装在2支无菌采集管内，其中一个管不加抗凝剂，另一个管加适量肝素抗凝用做细胞学检查；将样本贴好标识码标签，-80 ℃保存。

1.2.3.5 粪便样本的采集与保存 有文献证实，多种风湿病发病与肠道菌群失调相关[8]。因此，风湿病专病样本库样本也纳入了粪便采集。测定肠道菌群一般常用16SrRNA基因序列分析技术检测，因此，选择灭菌封口特定容器，收集2～5 g或2～5 cm3固态状(或2～5 mL液态状)新鲜粪便，无须离心，样本分管贴好标识码标签，-80 ℃保存。如果需要测定代谢物则将上法采集新鲜粪便用研钵研碎混匀，取0.5 g，置于50 mL离心管中，加入10 mL75%甲醇溶液，离心取上清液，加入10%氨水备用，采用气相色谱-质谱联用法分析。

1.2.3.6 DNA /RNA的提取 按试剂盒要求提取DNA；RNA的提取选用传统的Trizol法，标记，入库，分别储于-80 ℃冰箱和液氮罐。在样本收集到入库整个过程中，对从样本中提取的DNA/RNA样本，需定期抽查浓度、纯度，鉴定合格后可继续保存。所有样本应避免反复冻融。

1.3 临床资料库建立与信息采集系统管理 样本库管理软件采用IBIO-GENE V2.2.49.0版本，通过与医院信息系统(hospital information system,HIS)/实验室信息系统(laboratory information system,LIS)/广东省医疗机构病案统计管理系统(Guangdong Province medical institutions health record and statistics,MIS)对接,利用存储设备，完善管理(包括样本采集、患者信息、设备、实验信息、用户信息、统计辅助等多方面管理)，方便数据科研/临床提取及校正，提高了样本库工作效率。实现对样本状态和使用情况有序化、权限化、多中心的院级共享安全管理。

1.3.1 临床资料库建立与管理 包括：①临床信息采集；②信息整理入库；③原始纸质临床资料存放与管理；④出入库管理；⑤库存核实；⑥样本接收、运输、销毁、安全管理；⑦云端共享管理。

1.3.2 临床信息采集管理 将预录入样本的临床资料信息包括住院号/门诊号、性别、姓名(为保护患者隐私使用英文缩写)、诊断、家系、个人史、既往史、病史、实验室报告、药物治疗情况、预后与转归等所有信息输入信息系统内。

1.4 质控管理 质控管理包括质控人员管理和样本质控。生物样本库的质量控制包括流程控制和样本质量检测。

2 结果

2.1 样本收集情况 我院自2014年12月起筹建风湿免疫病生物样本库，于2014年12月开始收集样本，截至2019年7月31日，共计收集风湿免疫病病例736人次及52人次健康对照者，主要涉及8个病种，其中SLE 193人次，RA 149人次，OA 102人次，脊柱关节病40人次，骨质疏松症61人次，干燥综合征52人次，血管炎7人次，结缔组织病120人次。目前收集的788人次样本中，男性233人次，占29.6%；女性555人次，占70.4%，收集样本的年龄最小11岁，最大80岁。

2.2 样本管理

2.2.1 单个样本录入路径与质控 参照SOPS标准，生物样本库中样本的出入库全程实施标准化管理，必须按二维条形码识别定位归放并由专人负责管理。使用生物样本必须按照流程进行申请、审批、取样。在样本出库后管理员需追踪出库样本的基本试验数据，做到对样本的采集与库中质量的二次监管。为确保实验室全体员工熟悉生物安全法律、法规，建立生物安全意识，保证相关工作人员掌握开展工作必需的生物安全知识和技术，避免实验室感染，防止实验室事故，生物样本库工作人员需定期接受安全培训和考核。样本库收集部分血液、尿液样本编码及二维条形码见图1。

图1 生物样本库血液、尿液样本编码及二维条形码

因RNA、DNA易降解，存在不稳定性，为避免样本在今后使用时反复冻融降解RAN、DNA和影响蛋白质结构，应当尽可能将样本以最小单位分装。分装也同时是为了提取方便和减少样本浪费。样本质量控制根据不同样本情况采取不同手段。例如：液态样本(血清、血浆、尿液、关节液等)需对其中特定物质定期检测；固体组织如：滑膜成分，由病理专家等共同完成，通过显微镜检查和对核酸/蛋白质等大分子检测进行质控。质控包括数据、取材处理各个环节时间记录、形态复检、生物大分子稳定性分析等等。生物样本库质控每半年进行1次，随机采样3份，使用紫外分光光度计测RNA完整性。数据信息安全是生物样本库安全的重要组成部分，安全保存采集的数据，限定使用者权限，防止数据的非法获取。每个接触生物样本库信息系统的工作人员都应该签署一份保密协议，信息系统自动备份。

2.2.2 样本共同管理 采用IBIO-GENE科研数据库信息管理系统V2.2.49.0版本，实现样本储存、共享信息的可视化管理，同时具有检索、归类等多种功能。2017年，我院获得深圳市政府“医疗卫生三名工程”立项，成功引进上海交通大学医学院附属仁济医院沈南教授风湿病精准医学研究团队。通过数据库联网，实现跨地域、多中心与上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科生物样本库实现云共享。通过积极推动生物样本库利用，避免了“脏库”、“死库”发生。同时正在进一步吸引、扩大同行业合作单位和研究范围，期望实现多中心收集标本、建立华南地区生物样本库联盟，扩大和维持研究竞争力、可持续发展势态。

3 讨论

SLE，OA、RA等[9-10]风湿免疫病属于高度异质性风湿病，发病机制复杂，严重影响国民健康与国家经济。据统计，美国因此每年造成经济损失多达3 200亿美元以上。流行病学调查显示，我国仅RA的发病率达0.6%～1.0%，自身免疫性风湿病患者人数已超过1亿，到2020年将达2亿；而临床上SLE、RA等风湿免疫性疾病目前主要采用抗炎和免疫抑制方法进行治疗，以糖皮质类激素联合细胞毒药物为主，不良反应大，感染已成为风湿免疫性疾病致死的首要因素。因此，寻找风湿免疫病生物标志物、新的治疗靶向药、中西医结合等方向治疗成为全球共同关注问题。随着治疗手段不断更新，不同类型干细胞、富血小板血浆、影响自噬相关通路药物在OA、SLE等疾病治疗中应用[11]。专病生物样本资源是一类重要的生物样本资源[12],临床科研要验证医疗精准性，建立生物样本库、干细胞库的作用意义重大。

生物样本库模式目前有2类，一类是采用英国模式，即由政府出资组建生物样本库；另一类是采用欧盟模式，即建立“分散实体库+统一信息库”的生物样本库联盟网络[13]。国外相关专病生物样本库发展已经积累了一定的经验，值得我们参考。丹麦自2007年启动全国多中心风湿免疫病生物样本库建设[14]，目的是促进对炎症性风湿病患者进行个性化治疗以及新生物标志物的鉴定。2011年，欧洲抗风湿病联合硬皮病试验研究小组[15]建立了一个在线数据库，目的是通过队列研究开发系统性硬化症的新型生物标志物和寻求新的治疗方法,管理经验值得其他地区风湿免疫病生物样本库借鉴。

国内外现有的生物样本库都在积极开展资源共享、互相合作模式，通过共同搭建平台[16]，解决共享存在的普遍问题：样本质量评估、样本种类不全、供需双方信息未及时更新等[17]。近年来中国在生物样本库共享方面有一定的进展，以北京生物银行、国家基因库联盟为代表的生物样本库共享网络相继成立，国家规划层面也提出了生物样本库共享要求和设想，一些专病样本库建设标准陆续出台。我院建立的生物样本库主要采用分散实体库与统一信息库结合模式，通过重点专科专项经费维持，保证样本库正常运营。由于建立规范专病生物样本库与专科遗传资源、表观信息、分子流行病学调查等相应临床信息关系密切，在建立风湿免疫病生物样本库上，按照SOPS组织架构、专员管理、严格伦理流程和质控管理，推动专病生物样本库合理化、规范化、标准化、共享化发展。避免采集时间仓促、采集量不足、信息可信度差等缺点，确保样本的质量和数量。

2017年7月8日,国务院印发《新一代人工智能发展规划》,利用人工智能建立生物样本库“云”资源共享平台的设想已经提出[18]。国外在实现机构间合作研究方面有很多成功尝试例子，包括合作的前列腺癌组织资源，宾夕法尼亚州癌症联盟生物信息学联合会，合作乳腺癌组织资源，合作人类组织网络，癌症家族注册管理机构等，但尚未达成全球共享平台[19]。我们通过结构化采集方式、表单设计填写、医院HIS/LIS/MIS系统对接、二维码标识扫描规范临床数据采集流程，通过将工作流程转化存储生物样本到电子信息，设计并实施了备份解决方案，确保日常专科生物样本库的覆盖范围，并将备份资料分布到远程服务器或云共享APP上定期进行网络、操作系统、参数等优化，实现可视化管理，保证样本临床信息的完整准确、数据的完整性、真实性、统一性，无须增加人员成本和软件成本。我们与上海交通大学医学院附属仁济医院风湿科姊妹库共享资源、信息、技术及人才平台等，共同承担科研项目，实现地区专科产业突破。不但有效保护、合理开发和充分利用了专病生物资源，而且提高了专科研究水平，还促进了专病诊治进展及实现惠及民生的医疗目标，具有较大社会经济效益。多方合作生物样本库之间应确定统一完整的本体，数据集平台必须有上下级隶属合作关系，并成立第三方管理机构监管互通模式；应用信息管理软件，使用微软服务器及Excel编辑信息，通过严格审核、定制和开放共享网络共同管理，推动存量资源改造[20]。引入云计算和远端服务，检测温度、安全系统、样本追踪；加强顶层设计，落实监管、法律、资金和服务平台等保障;建立行之有效的生物样本库共享利益分配机制，认真贯彻伦理和生物安全保护。

目前我国生物样本库仍面临一些问题和挑战。相关的生物样本资源不断积累，却没有得到妥善的收集与整理、或者一些生物样本库得不到合理利用而成为“脏库”、“废库”、“死库”。如何实现现有生物样本资源共享，己成为当下各国生物样本库建设和发展所共同面对的难题。生物样本库的出现所带来的一些伦理、法律和社会问题，包括从弱势群体(临床上通常是患者)收集捐款的公平性，对捐助方而言的知情同意，向参与者披露数据的管理、知识产权所有权以及参与方的隐私和安全[21]。由于这些新的问题，研究人员和决策者需要建立新的研究治理体系。

期待以我院风湿免疫病生物样本库为基础，联合深圳市-广东省-华南地区更多合作单位，不断充实风湿免疫病的病种及系统生物样本，通过大样本的关联分析，实现大数据在生物样本库的充分价值体现，将有利于动态纵向观察风湿免疫病发生、发展和转归的规律。下一步将开展干细胞库建立和管理，为风湿免疫病临床和基础研究提供物质基础。