多巴胺受体亚型在乳腺癌中的表达检测

林 健，冯 拓，郁 越，李恒宇，盛 湲

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，约占女性所有肿瘤的30%，具有侵袭性，难治愈，且易复发或转移。近年来，乳腺癌死亡率已呈下降趋势[1]，然而，我国乳腺癌的发病率增长非常快[2]，复发转移率依旧较高。肿瘤转移是导致乳腺癌死亡的最主要原因，及时了解乳腺癌患者的肿瘤负荷，应用确切有效的治疗手段，准确掌握抗肿瘤治疗疗效，成为降低乳腺癌患者死亡率的关键。近年来一些研究发现，肿瘤细胞存在很大的异质性[3-4]。一些肿瘤细胞具有较强的自我更新能力，其生物学特征与干细胞的基本特性十分相似，因此，有学者提出肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)的理论[5]。这些CSC具有干细胞特性，包括自我更新、药物抵抗、迁移能力增强等特点，与肿瘤的复发转移和化疗抵抗密切相关，因此，CSC假说是理解肿瘤复发转移和药物抵抗的里程碑[6]。而寻找最具转移性和侵袭性的乳腺癌CSC是乳腺癌治疗和预后的关键。目前尚无公认的CSC的标志物，而以往报道的CD133、三磷酸腺苷结合转运体和乙醛脱氢酶1等生物标志物，在多种来源的干细胞膜均有表达，不能区分正常干细胞与CSC[7-9]。据文献报道，表达CD44+CD24-的乳腺癌细胞因具有肿瘤产生能力而被认为是CSC[10]，其表达与三阴性乳腺癌密切相关，普遍被认为是乳腺癌干细胞。

最新研究报道，多巴胺受体可能是一个CSC的生物标志物[11]，研究者发现正常人多能干细胞不表达多巴胺受体，而CSC表达所有5种多巴胺受体(DRD1-DRD5)，在三阴性乳腺癌中发现CD44+CD24-的CSC同样表达多巴胺受体。多巴胺受体拮抗剂硫利达嗪能通过表达在CSC上的D2受体家族，特异性地作用于CSC，抑制CSC的增殖生长。这不仅提示CSC特异性地表达多巴胺受体，并且能通过多巴胺受体信号途径靶向抗CSC治疗，也说明多巴胺受体既是一个CSC的生物标志物，也是一个潜在靶向抗CSC的药物靶点，具有十分重要的研究价值。但目前，多巴胺受体在乳腺癌中作用机制还不是十分清楚，尤其是多巴胺受体5个亚型在乳腺癌中的具体表达情况尚不清晰，这是开展多巴胺受体信号途径与乳腺癌机制研究的基础。本研究拟针对多巴胺受体5个亚型在乳腺癌中的表达情况进行检测，具体分析各亚型在乳腺癌及其癌旁组织中的表达情况和分布特征，并结合癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库中有关乳腺癌组织多巴胺受体表达情况进行进一步验证，为今后乳腺癌CSC的研究积累数据，也为未来多巴胺受体靶向药的开发利用提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从海军军医大学附属长海医院生物样本库中挑选2015年5月—2016年12月住院的20例确诊女性乳腺癌患者癌与癌旁组织样本，以及癌与癌旁组织石蜡包块，收集其临床病理资料。纳入标准：①无其他肿瘤病史；②术前未进行过任何抗肿瘤治疗；③病理证实为乳腺癌；④无其他严重系统性疾病或感染。所有患者的临床信息均从医院电子病历管理系统中提取，本研究经医院伦理委员会审核批准。患者均签署了正式的知情同意文件。20例女性乳腺癌患者，年龄(58.05±13.37)岁，肿瘤大小为(2.99±1.19)cm，腋窝淋巴结个数为(3.60±7.50)。按分子分型：Lumianl A型和Lumianl B型各有3例(15%)，HER-2阳性型4例(20%)，三阴性10例(50%)。其中行WB、IHC检测的5例患者年龄(59.60±15.06)岁，肿瘤大小为(3.82±1.46)cm，腋窝淋巴结个数为(0.80±1.79)。按分子分型：Lumianl A型、Lumianl B型、HER-2阳性型各1例(20%)，三阴性2例(40%)，病理诊断均为浸润性导管癌。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR) 从20例乳腺癌患者的癌和癌旁组织中剪取绿豆大小样本，使用RNAiso试剂(日本TaKaRa公司)抽提RNA，M-MLV试剂盒(日本TaKaRa公司)反转录cDNA，用SYBR Green/ROX qRT-PCR Master Mix(美国Thermo公司)试剂盒进行qRT-PCR。qRT-PCR特异性引物序列(上海生工生物工程股份有限公司)包括DRD1：正向5′-CTTCCTCAACGTTTCGGAGCC-3′，反向5′-AGCTCTCCAAACGCCTTGCCTT-3′；DRD2：正向5′-TGTACAATACGCGCTACAGCTCCA-3′，反向5′-ATGCACTCGTTCTGGTCTGCGTTA-3′；DRD3：正向5′-TCTGTGCCATCAGCATAGACAGGT-3′，反向5′-TAAAGCCAAACAGAAGAGGGCAGG-3′；DRD4：正向5′-TCTTCGTCTACTCCGAGGTCCA-3′，反向5′-TGATGGCGCACAGGTTGAAGAT-3′；DRD5：正向5′-TCATCTATGCCTTCAACGCCGACT-3′，反向5′-AGCTGCGATTTCCTTGTGGAAGAC-3′。qRT-PCR反应体系：SYBR Green+ROX 10 μL，上下游引物1 μL，cDNA模板2 μL，H2O 7 μL。qRT-PCR反应条件：95 ℃变性15 s；60 ℃退火15 s，共45个循环。以GAPDH基因为内参基因，根据2-ΔΔCt来估算多巴胺受体各亚型的相对表达量。

1.2.2 蛋白质印迹法(western blot，WB) 从20例乳腺癌患者中选取5例乳腺癌患者，将肿瘤组织剪碎，加入RIPA裂解液(含PMSF，蛋白酶等)提取总蛋白，以BCA法测定总蛋白浓度。每样本取20 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳结束后转膜，5%牛奶封闭1 h，一抗(1∶1 000)(jakson)4 ℃孵育过夜，1X TBST洗涤3次，二抗(1∶5 000)(jakson)孵育1 h，1X TBST洗涤3次，显色曝光。各目的蛋白与内参GAPDH的灰度值比值为相对表达量。

1.2.3 免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC) 相同的5例乳腺癌患者的癌和癌旁石蜡样本，进行组织切片。选择肿瘤组织面积较大、形态保存较为完好的石蜡切片，经脱蜡水化、3%H2O2甲醇液封闭、0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液抗原修复、1%BSA封闭，加一抗(absin)4 ℃过夜，加二抗(即用型，美国Thermo公司)室温孵育45 min，DAB显色、苏木素复染，脱水封片拍照。阳性细胞染色标准：细胞结构清晰，细胞膜染色明显，和背景对比清楚。每张切片随机选取5个高倍视野进行结果判定，按染色强度计分:未着色(0分)，淡黄(1分)，棕黄(2分)，棕褐(3分)。按着色细胞数占同类细胞总数计分：阳性细胞数≤5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，≥51%计3分。根据两项计分之和判定其结果，<3分计为阴性(-)，≥3分计为阳性(+)，≥4分为弱阳性(++)，≥6分为强阳性(+++)。使用Image-Pro Plus(IPP)软件测量多巴胺受体蛋白相对表达量。免疫组化染色阳性呈黄色，IPP软件通过测量图片中黄色光密度和面积，转化为蛋白相对表达量，半定量地得出多巴胺受体表达的值。

1.2.4 TCGA数据库分析 通过TCGA官网(https://cancergenome.nih.gov/)，以乳腺癌为关键词查找乳腺癌样本库，并筛选有多巴胺受体基因表达信息的样本，下载其临床病理资料(包括患者性别、年龄、临床分期、病理类型、乳腺癌分子分型、ER、PR、HER-2、腋窝淋巴结情况、手术术式、转移情况、生存情况)和基因表达数据。

2 结果

2.1 TCGA乳腺癌数据生物信息学分析结果 从TCGA数据库一共下载了112例乳腺癌患者癌和癌旁组织的多巴胺受体表达的数据，分析乳腺癌样本中多巴胺受体的5种亚型基因的表达情况(图1)。其中DRD4基因在癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.05)，DRD1和DRD2基因在癌组织中的表达显著低于癌旁组织(P<0.05)，DRD3和DRD5基因在癌和癌旁组织中的表达无显著差异(P=0.9565，P=0.5441)。分析112例乳腺癌患者临床病理特征与多巴胺受体亚型表达的关系，经统计分析发现：DRD1基因在乳腺癌中表达与年龄相关，按年龄50岁分层，大于50岁的患者更多表现为DRD1基因在癌中表达下调(χ2=13.852，P<0.05)。腋窝淋巴结转移情况，数量按0～3，4～9，9以上分层，发现与DRD4的表达可能存在相关性，腋窝淋巴结转移越少，DRD4在乳腺癌组织表达上调的比例越高(Likelihood Ratio=5.8，P=0.055)。而分子分型与多巴胺受体各亚型的表达关系比较密切，其中DRD1、DRD4基因表达情况在各分子分型之间差异显著(Fisher’s Exact Test，P<0.05)。

横坐标为112例样本，纵坐标为癌和癌旁组织对该基因表达的差值。0以上为该亚型在癌组织中表达上调，0以下为该亚型在癌组织中表达下调图1 TCGA数据库112例乳腺癌患者癌和癌旁组织多巴胺受体5个亚型的表达情况

2.2 qRT-PCR实验结果 20例患者的乳腺癌样本中，DRD1基因在9例样本中表达上调，11例样本中表达下调；DRD2-DRD4基因都发现在6例样本中表达上调，14例样本中表达下调；DRD5基因在4例样本中表达上调，16例样本中表达下调。多巴胺受体各亚型表达统计分析显示，DRD4基因、DRD5基因在癌组织中表达下调(11.17±5.04 vs 14.15±6.11；15.44±3.16 vs 18.29±3.34)，差异比较具有统计学意义(P<0.05)，未在其他3种多巴胺受体亚型发现癌与癌旁组织表达有差异(DRD1基因P=0.2436，DRD2基因P=0.1825，DRD3基因P=0.0839)，图2。结合20例乳腺癌患者的临床病理特征分析，只有DRD1基因在乳腺癌组织中表达情况与乳腺癌分子分型有关(Likelihood Ratio=10.246，P<0.05)，未能发现其余亚型表达情况与临床病理资料的相关性。

A-E为DRD1-DRD5各亚型表达情况，F为所有DRD的表达情况，横坐标为20例样本，纵坐标为癌和癌旁对该基因表达的差值。0以上为该亚型在癌组织中表达上调，0以下为该亚型在癌组织中表达下调图2 20例乳腺癌患者癌和癌旁组织多巴胺受体5个亚型的表达情况

2.3 WB实验结果 结果显示，DRD5、DRD4蛋白在癌组织和DRD1蛋白在癌旁组织的表达水平最显著(2.82±1.56，2.73±1.42，2.50±1.21)，其中DRD5、DRD4、DRD3蛋白在癌与癌旁组织中的表达，差异比较具有统计学意义(2.82±1.56 vs 0.65±0.58；2.73±1.42 vs 0.54±0.45；1.15±0.67 vs 0.34±0.19)(P<0.05)，DRD1、DRD2在癌与癌旁组织表达差异比较无统计学意义(1.31±1.03 vs 2.50±1.21；1.10±0.51 vs 0.57±0.39)(P>0.05)图3。

2.4 IHC结果 根据IPP图片分析软件结果，Graphpad软件绘图分析，提示DRD1、 DRD2、 DRD3、DRD5蛋白在癌旁组织表达高于癌组织(P<0.05)，且DRD5蛋白在癌旁组织的表达显著高于其他亚型在各组织中的表达(0.0445±0.0254，P<0.05)，图4。根据人工阅片，多巴胺受体染色主要位于细胞膜，DRD5癌旁组织染色显示强阳性(+++)，DRD5癌组织与DRD3、DRD2、DRD1癌旁组织染色显示为弱阳性(++)，其余亚型癌组织和DRD4癌与癌旁组织染色均较弱(+)，图5。

DRD4、DRD5蛋白在乳腺癌组织中表达较高而在癌旁组织中表达下调。DRD1蛋白在癌旁组织表达较高，DRD1蛋白在癌组织表达下调；DRD3蛋白在癌旁组织中表达下调，而DRD2在癌和癌旁组织中的表达差异不明显；GAPDH为内参基因图3 多巴胺受体的5种亚型在5例乳腺癌患者癌和癌旁组织中的蛋白表达情况

A-E为DRD1-DRD5癌与癌旁的IHC表达情况；F为各亚型在癌与癌旁表达情况的汇总图4 Graphpad软件绘图分析结果

T为癌，N为癌旁，BLANK为空白对照，比例尺代表20 μm 图5 DRD2、DRD3、DRD5蛋白癌与癌旁组织免疫组化染色情况

3 讨论

多巴胺是重要的儿茶酚胺类神经递质，通过多巴胺受体调节人体多个器官的生理功能[12]，而多巴胺系统功能异常，会产生诸如精神分裂症、亨廷顿氏病、帕金森病等疾病，临床上应用针对多巴胺受体的药物治疗此类疾病。多巴胺受体是由7个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体，主要分布在大脑、肾、肾上腺、交感神经节、胃肠道、血管和心脏等周围脏器，多巴胺受体根据他们的结构、生化和药理学特点分为两类：D1类和D2类受体。D1类受体包括DRD1和DRD5(以往又称D1B)受体；D2类受体包括DRD2，DRD3和DRD4。现在普遍认为，D1类和D2类受体在跨膜区域高度同源，但却具备不同的药理学特性，D1类受体唯一分布在突触后多巴胺受体细胞，能激活腺苷酸环化酶，产生环磷酸腺苷；而D2类受体抑制腺苷酸环化酶，与D1类受体相反，DRD2和DRD3在突触后靶细胞和突触前多巴胺能神经元上都表达[12-13]。

众多研究揭示，多巴胺及其受体在肿瘤的发生发展中也发挥重要作用[14]，已有应用多巴胺受体激动剂来治疗肿瘤，如溴隐亭、卡麦角林是治疗泌乳素瘤的一线用药[15]，也有一些临床试验，尝试使用多巴胺激动剂来治疗乳腺癌[16]。众多围绕多巴胺受体激动剂或拮抗剂与乳腺癌细胞的相关性研究表明，多巴胺受体参与了乳腺癌细胞的增殖、转移，而特定的激动剂或抑制剂通过多巴胺受体信号途径，能发挥抗肿瘤的作用，提示多巴胺受体在抗乳腺癌治疗的应用中具有巨大的潜力[17-20]。另外，研究发现多巴胺受体表达水平与乳腺癌预后相关，约30%的晚期乳腺癌中表达DRD1，并与更大肿瘤、更高等级、淋巴结转移和更短生存相关[21]。最新报道提示多巴胺受体有可能成为筛选CSC的生物标志[11]，尤其是CSC表达所有5种多巴胺受体，而正常人多能干细胞不表达多巴胺受体。

多巴胺受体在乳腺癌中的表达鲜有报道，1986年第一次报道人体乳腺中有多巴胺受体分布，发现正常乳腺组织多巴胺受体水平可忽略，而所有良性乳腺肿瘤表达可测量的低多巴胺受体水平，所有乳腺癌患者则表达更高水平的多巴胺受体水平，并且指出多巴胺及其受体可能与乳腺癌的发生发展有关[22]。这是第一次将多巴胺及其受体与乳腺癌联系起来，之后展开了众多围绕多巴胺及其受体与乳腺癌关系的研究，尤其是多巴胺受体抑制剂及激动剂的使用，更是促使了众多筛选多巴胺受体化合物用于抗肿瘤的研究[23-28]。

我们通过不同实验发现，多巴胺受体各亚型的表达水平在乳腺癌中的结果不尽相同。TCGA数据库生物信息学分析和IHC实验结果均提示DRD1、DRD2在乳腺癌组织中低表达，在癌旁组织高表达。而qRT-PCR、WB实验检测则提示两者癌与癌旁表达无差异。在IHC实验中提示DRD3蛋白在乳腺癌组织低表达，在癌旁组织高表达，而WB得出了相反的结果，其余分析及实验检测未得出差异结果。除IHC实验提示无差异外，TCGA数据库生物信息学分析、WB实验检测均提示DRD4蛋白在乳腺癌组织中高表达、在癌旁组织低表达，而qRT-PCR检测则得出了相反的结论。qRT-PCR检测和IHC实验均提示DRD5蛋白在癌旁组织高表达，在乳腺癌组织低表达，且提示DRD5在癌旁组织的表达高于所有亚型在癌和癌旁的表达，但是WB实验结果得出了相反的结论，TCGA数据库生物信息学分析未得出差异结论。

总之，多巴胺受体与乳腺癌密切相关，尤其令人瞩目的是，CSC特异性地表达多巴胺受体，正常人干细胞不表达多巴胺受体，使得多巴胺受体有可能成为筛选CSC重要的生物标志物，成为靶向抗CSC的理想靶点。开展多巴胺受体各亚型在乳腺癌中的表达研究，有助于更好地利用多巴胺受体作为特异性的生物标志物用于CSC筛选、靶向药物开发，这将是今后研究的一个热点。