关于高粱抗蚜基因定位的研究

黄为

摘   要：为害高粱的蚜虫主要包括高粱蚜和麦二叉蚜，采用传统农药抗蚜的方式有诸多副作用，因此通过抗蚜基因定位来培育高粱抗蚜品种是最有效的抗蚜方法。通过构建感蚜品种Btx623杂交产生的子二代群体的96个单株进行全基因组SSR引物筛选和鉴定，最终挑选47对有多态性的SSR标记，构建了一张分子标记遗传连锁图谱，并通过IciMapping软件将基因型与抗蚜表型计算连锁关系。研究结果表明，在二号染色体上找到两个主效的QTL位点，分别位于S2-6与SSR-15、SSR-15与SSR-16之间，研究成果可以为高粱抗蚜的分子标记辅助育种提供理论指导。

关键词：高粱;蚜虫基因;QTL;SSR

过去十余年中，有关高粱抗蚜基因的研究一直不断取得突破和进展。1982年，徐守珍等人鉴定了500余份国内外种质资源的抗蚜性，发现TAM428与Dubor2高抗高粱蚜。2002年，Katsar等人对蚜虫抗性的研究发现至少10个位点位于8个连锁群上，与蚜虫生理型C、E、I和K抗性相关，抗性位点都来源于抗性亲本TX278。2002年，李玥莹等人以BTAM428×ICS-12B杂交后代建立的抗感群体为试材，设计特异性引物，将RAPD标记（随机多态性DNA标记）转化为SCAR标记（可对RAPD标记末端测序）得到了差异扩增的结果，从而为分子标记辅助育种提供了可靠的依据。2013年，王道文通过构建BTx623和HN16杂交产生子四代群体，证明显性基因RMES1为抗蚜基因，位于6号染色体上。这些研究均提供了研究基础，主要比较不同高粱个体的基因型与表型差异以及定位高粱的抗蚜基因[1]。

1   研究方法

1.1   研究思路

高粱共有10对染色体（2n=20），其基因组中含735Mbp。为了在其中寻找抗蚜基因，选择通过SSR标记（近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术）进行QTL定位（数量性状座位或者数量性状基因座，是控制数量性状的基因在基因组中的位置）。在每个染色体上选择2～8处标记，共47对有多态性的SSR标记。一共获取96份不同高粱叶片作为样本，从中提取DNA模版，通过跑胶后所得的带型与表型比对，选择与表型一致或相似度最高的标记，即可得到与抗蚜基因连锁最紧密的标记，而抗蚜基因必在该区间中，可计算重组率大致定位。

1.2   试验仪器

剪刀、打样机、微量移液器、恒温箱、离心管、紫外/可见光分光光度计、PCR仪、玻璃板、齿梳、电源、回旋震荡仪、IciMapping软件等。

1.3   试验材料

试验材料以亲本A6235（抗蚜）与BTx623（感蚜）杂交后所得的96株子二代作为试验材料。试验药品选择无菌蒸馏水、乙醇、液氮、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、氯仿-异戊醇、异丙醇、mix（含Mg2+、dNTP、DNA聚合酶）、电泳用胶、TBE（Tris硼酸）等。

1.4   试验步骤

1.4.1   筛选标记

（1）筛选片段。选择277对引物，将两亲本进行PCR、电泳，观察亲本多态性，筛选可做QTL标记的片段。QTL标记指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置。对QTL的定位必须使用遗传标记，人们通过寻找遗传标记和感兴趣的数量性状之间的联系，将一个或多个QTL定位到位于同一染色体的遗传标记旁。

（2）确定标记。根据带型对比，选择差异最为明显的标记，最终在277对引物中筛选出47对作为标记。以每处标记为1组，共6组，进行后续试验。

1.4.2   提取DNA

（1）取叶片。每剪取1片叶片后使用乙醇洗剪刀避免污染，并用液氮保存取下的葉片。

（2）打样。将叶片与钢珠放入打样机中，以12000r/min共打样40s。

（3）加入CTAB。用微量移液器向每管样品中加入CTAB800μL，迅速振动。最后将所有样品置于65℃的恒温箱中放置60min，以破碎细胞。

（4）离心。用微量移液器向样品中加入600μL24∶1的氯仿-异戊醇轻晃，以1000r/min离心10min，最终上层水相溶有DNA。

（5）沉淀。取1.5mL离心管，用微量移液器加入600mL异丙醇，使DNA析出为白色沉淀。在-20℃的环境下放置10min。

（6）洗沉淀。以10000r/min离心5min去上清液，用微量移液器加入800μL75%乙醇轻晃，以洗沉淀。

（7）风干。离心4min倒出乙醇，放入通风橱晾干。

（8）加入100μL无菌蒸馏水，使用紫外/可见光分光光度计测所得DNA浓度。

1.4.3   PCR

（1）调配反应体系。向提取的DNA模版中加入水、左右引物与mix。

（2）准备解链。将所有样品置于PCR仪中，条件为94℃、5min。

（3）彻底解开双链。条件为94℃、30s。

（4）退火，结合引物。条件为55～58℃、30s。

（5）DNA聚合酶延伸（1000bp/min）。条件为72℃、30s。

（6）充分反应。条件为72℃、10min。

（7）在16℃环境下冷却。

说明：第3～5步为1个循环，共需循环32～35次。

1.4.4   PAGE（核酸电泳）

（1）组装模具。将两块洗净的玻璃板拼接在一起，用适量胶封底。

（2）制胶。胶浓度为8%，100mL胶中含52.7mL水、26.6mL30%Acrylamide、20mL5×TBE、0.7mL10%过硫酸铵、0.065mLTEMED。

（3）注胶。将所制胶倒入玻璃板间，插上齿梳，等待凝固，并在模具架间倒入适量TBE作为缓冲液。

（4）点样。用微量移液器向取下齿梳后形成的凹槽中滴入PCR后的样本。

（5）电泳。将正负极连接上导线，接150V、3h。

（6）染色。取下玻璃板间凝胶后，浸泡在AgNO3溶液中20min，浸泡在NaOH溶液中20min，其间皆置于回旋式震荡仪上震荡。

（7）取胶，拍照。

2   研究结果与分析

分子标记遗传图谱如图1所示，由IciMapping绘制，为高粱各染色体，其上标有所选标记;对得到的波峰数据分析，利用IciMapping绘制基因型和表型的连锁关系，在log图中寻找波峰，纵坐标LODScore≥2.5时，即视为该标记处存在QTL，抗蚜基因的可能性极高。由以上结果可知，在二号染色体上存在LODSCORE明显高于2.5的QTL2个波峰。抗蚜基因定位（2号染色体）如图2所示，放大二号染色体标记图分析可知，两抗蚜基因存在于S2-6与SS-15以及SSR-15与SSR-16之间。

利用QTL定位并比对基因型与表型的方法，在高粱二号染色体S2-6与SSR-15、SSR-15和SSR-16之间定位了2处抗蚜基因，从而有效防治蚜虫危害。

参考文献：

[ 1 ] 刘国庆，杜瑞恒，侯升林，等.高粱抗蚜研究进展[J].植物学报，2012，47（2）：171-187.

（收稿日期：2019-11-23）